温针灸对大鼠脊髓损伤节段神经再生抑制因子RhoA、RockⅡ表达的影响

党仟仟，周宾宾，曾俊林，曾智鹏，唐 攀，李欣忆

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)是一种严重的中枢神经损伤，可引起永久性的功能障碍，致残率较高，给患者家庭和社会经济带来了沉重的负担。近年来，SCI的发病率逐年上升[1-2]。由于中枢神经系统的复杂性，目前尚未发现对SCI有效的治愈方法。西医针对SCI急性期主要采用手术减压、静脉注射大剂量甲基强的松龙，稳定期予抗炎、神经保护药物，恢复期主要采用康复理疗等方法[3]。然而，手术不可控的高风险、药物疗效的争议不断、康复理疗的周期漫长均是SCI治疗的难点。近年来研究发现，中枢神经轴突的表面有一层富含胶质细胞的髓鞘，髓鞘受损后，轴突将暴露在含有神经再生抑制因子(MAIF)的髓鞘碎片中，并活化重组人Ras同源物基因(Rho)，激活下游Rho蛋白激酶Ⅱ(Rho-associate kinase Ⅱ，RockⅡ)引起肌动蛋白细胞骨架重组、髓鞘磷酸化，导致生长锥塌陷，使轴突再生失败[4]。提高中枢神经再生能力的有效策略是阻断抑制信号通路，保护受损神经元，防止生长锥的塌陷而丧失可塑性。

针灸是中医学的重要组成部分，广泛应用于临床多种疾病的治疗和预防，与药物比较，针灸具有操作简单、不良反应少等优势。现代医学发现，针灸具有抗氧化作用，不同形式的针刺治疗均能有效促进SCI后神经功能的恢复、增强神经再生能力[5]。温针灸结合了针可通脉、灸可补阳的优势，临床研究证实，温针灸可以通过保护受损的神经元、抑制细胞凋亡促进SCI的恢复[6]。本实验通过温针灸干预大鼠SCI模型，检测大鼠神经再生抑制因子RhoA、RockⅡ的变化，探讨温针灸治疗SCI的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性SD大鼠40只，体重180～200 g，购自湖南长沙天勤生物技术有限公司，动物许可证号[SCXK(湘)2019-0014]。本研究所有实验均在广西中医药防治医学分子生物重点实验室完成，实验大鼠在标准动物饲养房中喂养，湿度40%～47%，温度26 ℃左右，光照10 h黑暗14 h交替，适应性喂养1周。

1.2 主要仪器 匀浆机(T18)，低温离心机(5418R)，Real-time PCR System(Aria Mx)，核酸检测仪(FC-1100)，光学显微镜(BX53)，蛋白转印模，电泳仪。

1.3 主要试剂和药物 RIPA裂解液(R0010)，Anti-RhoA(K001649P)，Anti-RockⅡ(K008935P)，山羊抗兔IgG(ab6721)，逆转录试剂盒(MR05101)，Universal SYBR qPCR Mix(11201ES03)，Tri Quick Reagent(R1100)，盐酸法舒地尔(H20040356)，清艾条(Z32020253)，1%戊巴比妥钠(F20020915)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组、建模及干预：40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、温针灸组和法舒地尔组，每组10只，再根据干预时间节点分为7、14 d两个亚组。假手术组手术咬除大鼠椎板，暴露脊髓；其余三组建立半横断SCI模型。半横断SCI模型制备方法：大鼠称重，腹腔注射0.1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，大鼠深度麻醉后，取俯卧位，定位T10椎体；以T10为中心消毒、开皮，分离皮下组织，去掉T10椎板，暴露脊髓；用无菌手术刀片以脊髓上附着的中央血管作为切入点，切断右侧脊髓(不可跨越中间的血管及对侧脊髓)，造模成功的标志为大鼠后肢、躯干、尾巴痉挛性抽动，肉眼可见脊髓断端分离；分层缝合，术后每天1次人工按摩腹部排便，避免术后肠梗阻、尿潴留等并发症增加大鼠死亡风险。造模后，温针灸组参照《实验针灸学》选取大椎、命门穴，消毒后进针约2～3 cm，得气后在针柄固定艾条施灸，每次3壮，灸完后留针15 min，1次/d，施灸过程防止艾条脱落烫伤对实验结果产生影响。法舒地尔组大鼠造模成功后，100 mg盐酸法舒地尔冻干粉溶于100 ml的0.9%氯化钠溶液腹腔注射，10 ml/kg，1次/d，每周6次。

1.4.2 取材：分别于干预7、14 d取材，操作如下。组织病理染色、免疫组化取材：腹腔注射0.1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠，剃毛、消毒，打开胸腔，暴露心脏；将灌胃针从心尖部插入主动脉，剪开右侧心耳，快速注入0.9%氯化钠溶液200 ml冲洗血液，再用4%多聚甲醛溶液350 ml缓慢灌注，至大鼠四肢、躯干、尾巴等全身组织僵硬，分离T10节段脊髓，取损伤段上下5 cm的组织，立即放入4%多聚甲醛缓冲液常温保存备用。WB、PCR取材：大鼠深度麻醉后，冰上迅速取材，并保持取材过程无菌、无酶，将组织放入冻存管中，-80 ℃冰箱保存备用。

1.4.3 组织病理染色：HE染色方法为，将组织修剪后放入脱水盒中，脱水、浸蜡后包埋，制作成蜡块备用；用切片机切取3 μm切片，48 ℃温水中展片，65 ℃烤片过夜；配制梯度乙醇、苏木精、伊红等染色剂，上机自动化完成染色、封片等；取出封闭好的玻片在Olympus BX53显微镜下观察组织形态学变化。尼氏染色：将石蜡包埋的组织切片常规脱蜡至水；用尼氏染色液(甲苯胺蓝法)置于50～60 ℃温箱浸染20～40 min，蒸馏水冲洗多余的染液；95%乙醇迅速分化后用无水乙醇脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，镜下观察尼氏体细胞的形态变化。

1.4.4 免疫组织化学染色：石蜡切片常规脱蜡至水，自来水冲洗2 min，蒸馏水浸泡5 min；在抗原修复液中微波炉中火加热5 min，继续低火加热10 min，完成修复后自然冷却；PBS洗片3次，每次5 min，加3%H2O2室温避光孵育10 min，PBS洗片3次，每次5 min；滴加5%正常山羊血清(1×PBS稀释)涂覆样本，放入湿盒37 ℃封闭1 h；取出Anti-RhoA Polyclonal Antibody、Anti-RTN4 Polyclonal Antibody、Anti-RockⅡ Polyclonal Antibody抗体，冰上解冻，根据抗体说明书推荐抗体稀释比例为1∶400，去掉切片上多余的封闭液，将现配的一抗稀释液均匀滴加在玻片表面覆盖组织，4 ℃孵育过夜；水平摇床PBS洗片3次，每次5 min；根据抗体说明书取Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)抗体稀释比例为1∶1000，去掉切片表面液体，将配好的二抗稀释液滴在玻片表面覆盖组织，37 ℃孵育30 min；水平摇床PBS洗片3次，每次5 min；加现配的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，目的蛋白逐渐显色而背景无显色时，用自来水冲洗终止显色；苏木素染色、盐酸酒精分化后，返蓝；常规脱水封片，光学显微镜下镜检。

1.4.5 qRT-PCR检测RhoA、RockⅡ表达：取30～50 mg组织，用Tri Quick Reagent提取总RNA，测定浓度；用逆转录试剂盒在DNA聚合酶的作用下将RNA逆转录成cDNA；荧光定量PCR仪进行cDNA扩增检测，反应程序：95 ℃ 30 s；PCR循环(40个循环)：95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s；反应体系为2×Universal SYBR qPCR Mix 7.5 μl，上、下游引物各0.6 μl，cDNA 1 μl，超纯水5 μl。记录每个样本所对应基因的Ct值，2-△△Ct法分析目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 各组大鼠HE染色 见图1。假手术组大鼠脊髓组织结构致密，神经元分布均匀，灰质和白质边界清楚，灰质呈蝴蝶状，白质排列整齐，神经细胞形态完整。模型组干预7 d，结构极度紊乱、缺损，细胞炎性浸润，灰质区神经元数量减少；干预14 d，脊髓结构紊乱依然存在，炎性浸润稍有改善，组织液化坏死，空洞形成。温针灸组、法舒地尔组干预7 d，组织结构紊乱，有较多的炎性细胞，病理改变程度较模型组轻；随着治疗时间的延长，干预14 d后上述组织形态变化较之前有好转，组织结构呈中度紊乱，神经元数量有所增加，炎性细胞减少，但仍有小胶质细胞增生。

注：A、C(×50)，B、D(×200)

2.2 各组大鼠尼氏染色 见图2。假手术组大鼠神经元胞浆中的尼氏小体分布集中，呈蓝色斑块和条索状，大小适中，尼氏染色清晰；模型组大鼠尼氏细胞数量减少，分散分布，尼氏小体固缩，呈异常的小颗粒状，部分细胞溶解，尼氏染色较暗淡不清；温针灸组和法舒地尔组较模型组明显改善，尼氏细胞形态明显恢复，分布较为密集，着色相对均匀、清晰，尼氏小体仍有不同程度缺失。

图2 各组大鼠7、14 d脊髓病理形态(尼氏染色，×200)

2.3 各组大鼠脊髓组织Rock Ⅱ、RhoA蛋白表达比较 见表2(图3)。免疫组化结果显示，Rock Ⅱ、RhoA主要在胞浆中呈棕黄色阳性表达，阳性细胞胞体可缩小变圆。假手术组干预7、14 d，Rock Ⅱ、RhoA蛋白均呈低水平表达，差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，模型组同时间节点Rock Ⅱ、RhoA蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，温针灸组、法舒地尔组各时间点Rock Ⅱ、RhoA蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与干预7 d比较，温针灸组、法舒地尔组干预14 d时Rock Ⅱ、RhoA蛋白表达均降低，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠脊髓组织Rock Ⅱ、RhoA蛋白表达比较

图3 各组大鼠RockⅡ、RhoA表达(免疫组化，×400)

2.4 各组大鼠脊髓组织Rock Ⅱ、RhoA mRNA表达比较 见表3。干预7、14 d，假手术组Rock Ⅱ、RhoA mRNA均呈低水平表达，差异无统计学意义(P>0.05)。干预7、14 d，模型组Rock Ⅱ、RhoA mRNA表达高于假手术组同时间节点，差异有统计学意义(P<0.05)。干预7、14 d，温针灸组、法舒地尔组Rock Ⅱ、RhoA mRNA表达均低于模型组同时间节点(P<0.05)。与干预7 d比较，温针灸组、法舒地尔组干预14 d的Rock Ⅱ、RhoA mRNA表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠脊髓组织RockⅡ、RhoA mRNA表达比较

3 讨 论

SCI是目前医学领域难以攻克的课题之一，尽管中枢神经系统具有一定再生能力，但仍然难以建立有效的神经传导通路。SCI后多种抑制信号通路的激活降低了神经微弱的再生能力。Rho/Rock信号通路是多种抑制蛋白的汇合点，在介导SCI和神经再生中起着重要作用[7]。RhoA是一种小GTPase蛋白，属于Rho GTPase家族，包含Rho、Rac、Cdc42等7个亚族；RhoA介导黏着斑和应力纤维的形成，调节细胞极性，为细胞黏附、迁移和形态改变提供力量[8]。Rock属于丝氨酸苏氨酸激酶的AGC(PKA/PKG/PKC)家族，是RhoA的下游因子，有RockⅠ和RockⅡ两个亚组，在氨基酸和激酶结构域上有较高的相似性[9]。RhoA、RockⅡ参与调节细胞的基本功能，包括收缩、运动、增殖、基因表达和细胞的凋亡[10]。基础和临床研究均表明，抑制RhoA/Rock通路是治疗中枢神经系统疾病的有效方法[11]。法舒地尔是目前唯一应用于临床的Rho/Rock抑制剂，可特异性地抑制RockⅡ因子的表达，改善大鼠SCI后灰质和白质的血供，增加轴突出芽[12]。临床主要将其用于改善脑血管痉挛、促进损伤的神经恢复，法舒地尔还具有抑制HL-60细胞增殖、诱导凋亡、促进分化及抑制侵袭等作用[13-14]。研究发现，法舒地尔的药效维持期为4周，延长治疗无效，并且存在一定的不良反应，其临床安全性有待证实[15]。

本研究基于Rho/Rock信号通路从分子水平探讨温针灸治疗SCI的机制，通过病理染色、免疫组化和qRT-PCR等现代生物分子学技术检测各组脊髓组织中RhoA、RockⅡ因子表达。本研究结果显示，SCI后RhoA、RockⅡ因子的表达较假手术组显著升高，表明Rho/Rock为SCI后的抑制信号，对损伤的神经修复有负面阻碍作用；温针灸组各时间节点RhoA、Rock Ⅱ表达均低于模型组，表明温针灸治疗可抑制Rho/Rock信号通路，对SCI恢复有促进作用；病理染色结果显示，温针灸组损伤组织病理改变较模型组明显减轻，炎性细胞减少，形态恢复，表明温针灸可以增强炎症吸收、促进水肿消退，促进组织恢复；温针灸组在干预14 d的RhoA、RockⅡ因子表达显著低于7 d，组织形态改善程度也优于7 d，说明温针灸可以延长治疗周期。

针灸对功能性损伤及SCI的病理改变有积极治疗作用[16]。SCI属于“督脉”损伤，属于中医“痿证”范畴，主要病机为督脉受损，阳气不足，气血不通，机体废痿失用[17]。《名医别录》载：“艾味苦，微温，无毒，主灸百病”。艾灸具有芳香透窍、温阳通络之效，其药效能贯穿全身十二经络。现代医学研究发现，艾灸除了穴位刺激、温热传导的理化效应外，艾条在燃烧时产生的红外线具有高效穿透力，刺激穴位产生“受激共振”效应，借助反馈调节机制，改善局部血液循环、营养状态，为机体细胞活动提供必要能量，加速受损神经、组织的修复[18-19]。临床研究显示，温针灸能有效改善患者的神经功能，减少氧化应激反应，降低体内炎症因子水平[20]。研究发现，温针灸可促进受损脊髓γ-氨基丁酸的分泌，改善大鼠的肢体痉挛，上调Shh、Gli-1因子表达，促进髓鞘形成和神经回路重建[21-22]。

综上所述，温针灸可促进大鼠SCI后组织形态恢复，提高神经再生能力，作用机制可能与下调受损节段RhoA、RockⅡ因子的表达相关。