基于JAK2/STAT3信号通路探讨香仁胃舒汤治疗慢性非萎缩性胃炎大鼠机制

唐丽萍，曾于恒 ，王容容 ，柏正平

(1.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410208；2.厦门市中医院，福建 厦门 361015；3.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006)

慢性非萎缩性胃炎(Chronic non-atrophic gastritis,CNAG)的发病率逐年攀升，当其病情进展至慢性萎缩性胃炎或胃溃疡时，则可能发生癌变，严重影响患者生活质量[1-2]。CNAG患者可见胃黏膜充血水肿，伴有黏膜层大量浆细胞和淋巴细胞浸润[3]。现如今临床上仍未有理想的治疗CNAG方法。中医诊治思想中的“未病先治，既病防变”在防止CNAG的发生发展有明显的优势[4-5]。香仁胃舒汤由木香、砂仁、枳壳、厚朴等药组成，诸药合用，共宣疏肝、健脾、和胃之效。临床上对CNAG患者用香仁胃舒汤治疗取得一定成效，但其作用机制尚不明确[6]。有研究报道JAK2/STAT3信号通路在CNAG发病机制中具有重要作用[7]。本研究将基于JAK2/STAT3信号通路探讨香仁胃舒汤对CNAG大鼠的作用机制，以期为临床治疗CNAG提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验大鼠 选取SPF级SD雄性大鼠60只，体重约200 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2019-004。本实验经医院实验动物管理委员会审核并批准。

1.2 药物与试剂 香仁胃舒汤由木香、砂仁、枳壳、厚朴、乌药、莱菔子、鸡内金、党参、白术、佛手、郁金、黄芩、蒲公英、白芍、沉香及炙甘草组成，购自亳州市方珍中药饮片厂。奥美拉唑肠溶片购自江苏联环药业股份有限公司(国药准字H10890267)；水杨酸钠(山东多聚化学有限公司)；氨水(济南富浩化工有限公司)；脱氧胆酸钠(山东科建化工有限公司)；苏木素-伊红(HE)试剂盒(上海科博瑞生物科技有限公司)；P-JAK2、JAK2、STAT3一抗(北京博奥森)，二抗(中杉金桥)；大鼠P-JAK2、JAK2、STAT3酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(上海研辉有限公司)；白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-1β(IL-1β)大鼠ELISA试剂盒(欣博盛生物技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(上海抚生实业有限公司)。

1.3 实验仪器 Olympus CX23正置显微镜(济南千司生物技术有限公司)；BECKMAN X-30R高速冷冻离心机(美国贝克曼)；Varioskan LUX多功能酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)；BEP-300l电泳槽(济南博坤科学仪器有限公司)；Tanon-n2500全自动数码凝胶图像分析仪(济南千司生物技术有限公司)。

1.4 造模、分组与给药

1.4.1 建立模型：以化学刺激联合饥饱失常法构建CNAG大鼠模型，大鼠每日饮用0.02%氨水溶液，联合饥饱失常，即1 d禁止饮食，2 d过饱饮食；每周分别进行2次、3次灌胃(20 mmol/L脱氧酸钠溶液和2%水杨酸钠混悬液)。于造模后30 d后随机选取2只大鼠检测胃黏膜组织病理学，以胃黏膜组织的病理变化判断模型是否复制成功[8]。

1.4.2 分组与给药：将造模成功后的40只存活大鼠随机分为五组，分别为模型组、奥美拉唑组和香仁胃舒汤高、中、低剂量组，每组8只。另选取8只正常SD大鼠作为正常组。奥美拉唑组给予60 mg/kg奥美拉唑溶液3 ml灌胃，香仁胃舒汤高、中、低剂量组给予270、180、90 mg/kg香仁胃舒汤3 ml灌胃，1次/d，均连续灌胃4周。正常组和模型组提供等量0.9%氯化钠溶液连续灌胃4周。用药结束后麻醉大鼠，留取大鼠血清及胃黏膜组织观察指标。

1.5 观察指标

1.5.1 胃黏膜组织病理学变化及病理评分：取大鼠胃部组织，进行常规石蜡包埋，切片，用HE染色法分析其胃黏膜组织病理改变。分别将胃黏膜炎症、炎症变化、肠上皮化生、非典型增生及萎缩按无(0分)、轻度(1分)、中度(2分)、重度(3分)计分，将各个病理组织变化得分相加得到病理评分[9]，同时记录胃体、胃窦黏膜组织病理评分。

1.5.2 血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β检测：用ELISA测定大鼠血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平，取大鼠血清，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5.3 胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β表达：用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β表达，按照BCA蛋白定量试剂盒对大鼠胃黏膜组织蛋白含量进行测定，制备凝胶，每个孔上样35 μg蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，在室温条件下用5%脱脂奶粉密闭1 h，在4 ℃条件下孵育12 h一抗(浓度：JAK2和STAT3为1∶1000；P-JAK2、IL-8及IL-1β为1∶3000∶3000)，在室温条件孵育二抗2 h，再加增强型化学发光试剂(ECL)使条带显影。

2 结 果

2.1 香仁胃舒汤对CNAG大鼠胃黏膜组织病理学变化及病理评分影响 见表1。正常组大鼠胃黏膜组织形态正常，腺体结构完整，分布少量炎性细胞。模型组大鼠胃黏膜组织边界不完整，黏膜层可见明显充血性水肿，伴有大量炎性细胞和淋巴细胞浸润渗出；治疗4周后，奥美拉唑组和香仁胃舒汤高剂量组大鼠胃黏膜组织形态基本正常，仅见少量炎性细胞渗出；香仁胃舒汤中剂量组大鼠胃黏膜组织边界较为完整，伴有少量炎性细胞渗出；香仁胃舒汤低剂量组大鼠胃黏膜组织边界较为完整，黏膜层可见轻度水肿，仍伴有较多炎性细胞渗出(图1)。与正常组比较，模型组胃体及胃窦黏膜组织病理评分均升高(P<0.05)；与模型组比较，奥美拉唑组和香仁胃舒汤高、中、低剂量组评分均升高(P<0.05)；与奥美拉唑组比较，香仁胃舒汤中、低剂量组评分均升高(P<0.05)。

表1 各组大鼠胃黏膜组织病理评分比较(分)

A：正常组；B：模型组；C：奥美拉唑组；D：香仁胃舒汤低剂量组；E：香仁胃舒汤中剂量组；F：香仁胃舒汤高剂量组

2.2 香仁胃舒汤对大鼠血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平的影响 见表2。与正常组比较，模型组、奥美拉唑组和香仁胃舒汤各剂量组血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平均升高(P<0.05)；与模型组比较，奥美拉唑组和香仁胃舒汤各剂量组JAK2、STAT3、IL-1β水平均降低(P<0.05)；与奥美拉唑组比较，香仁胃舒汤中、低剂量组P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平均升高(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平比较

2.3 香仁胃舒汤对胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表达水平的影响 见表3(图2)。与正常组比较，模型组、奥美拉唑组和香仁胃舒汤高、中、低剂量组胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表达较高(P<0.05)；与模型组比较，奥美拉唑组和香仁胃舒汤高、中、低剂量组胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表达较低(P<0.05)；与奥美拉唑组比较，香仁胃舒汤中、低剂量组胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表达较高(P<0.05)。

表3 各组大鼠胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白相对表达水平比较

A：正常组；B：模型组；C：奥美拉唑组；D：香仁胃舒汤低剂量组；E：香仁胃舒汤中剂量组；F：香仁胃舒汤高剂量组

3 讨 论

CNAG的病因病机复杂，尚未完全清楚其发病机制[10]。临床上可见胃黏膜充血水肿，伴有黏膜层大量浆细胞和淋巴细胞浸润，治疗效果不理想。中医诊治思想中的“未病先治，既病防变”在防止CNAG的发生发展有明显的优势。中医药在治疗CNAG方面有一定优势[11]。针对CNAG的发病绝大多数中医学者认为：饮食不节、素体虚弱、外邪、情志不畅等可致脏腑功能紊乱[12]。其病机为脾胃受损致胃失和降，脾失健运，脾胃纳运、升降的功能失调，气机郁滞，日久可表现为“气滞”“湿热”“血瘀”等虚实夹杂病理征象，从而使病情逐步恶化[13]。“脾胃升降失调”为CNAG及其癌前病变的发病根本，“邪在胃脘、久酿成毒”是CNAG及其癌前病变发生发展的重要因素，“脾虚络阻、虚实夹杂”为CNAG及其癌前病变的基本病机[14]。故脾失健运是CNAG病机演变的关键所在。脾胃虚弱，肝气不和，升降失调，治宜疏肝解郁，健脾和胃。香仁胃舒汤中党参、白术健脾益气；木香、砂仁、枳壳、厚朴等行气解郁；白芍、乌药行气柔肝止痛；沉香行气降逆；黄芩、蒲公英清热解毒；炙甘草补脾和胃，调和诸药。诸药合用，一升一降共奏调节气机之功，行气和胃[15]。

本研究通过构建大鼠模型，分别以不同剂量香仁胃舒汤给药。结果显示，香仁胃舒汤高剂量组能降低大鼠胃体及胃窦黏膜组织病理评分、血清P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平及胃黏膜组织P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β蛋白表达，起到调控细胞增殖、凋亡的作用。研究表明香仁胃舒汤可在一定程度上修复CNAG大鼠胃黏膜损伤，治疗效果良好。JAKs是一类蛋白酪氨酸酶，JAK2是其家族中的一员。STAT3在较多癌症中呈高表达。JAK2/STAT3信号通路可诱导细胞增殖、凋亡及免疫调节等，参与多种肠道炎性疾病及肿瘤的发生发展，其抑制剂可有效减缓疾病的发展，具有良好的临床疗效[16]。IL-1β为趋化因子家族中的一种细胞因子，不仅有较强的抑酸作用，还能促进IL-6的产生，是诱发CNAG的关键因素[17]。IL-8作为一种强力中性粒细胞趋化因子，IL-1β诱发的炎性细胞浸润很有可能是通过诱导以IL-8为代表的趋化因子而产生的[18]。IL-8可通过激活和趋化中性粒细胞使机体产生炎症反应，进一步使胃黏膜组织受损[19]。在病理状态下，大量IL-8、IL-1β与细胞膜上受体结合，导致细胞内JAK2大量聚集同时引起磷酸化，从而生成P-JAK2。P-JAK2通过激活细胞质内STAT3，使STAT3进入细胞核内，继而发生磷酸化，生成P-STAT3刺激下游信号因子，如IL-8、IL-1β等生成，介导细胞增殖、凋亡，加重炎性细胞浸润，加速炎症发展[20]。

综上所述，香仁胃舒汤对CNAG有一定的治疗效果，能改善胃黏膜组织损伤程度，降低P-JAK2、JAK2、STAT3、IL-8、IL-1β水平。其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路开放有关。中药复方汤剂是通过多靶点、多途径发挥治疗作用，香仁胃舒汤所用药味较多，故需在日后的研究中进行中药组分研究，明确香仁胃舒汤治疗CNAG的具体机制。