基于透明微针拉曼原位检测H2O2

彭 程，王 丰，杨海峰

（上海师范大学化学与材料科学学院，上海 200234）

0 引言

过氧化氢（H2O2）是一种活性氧（ROS）物种，参与体内重要的生理变化过程［1］，其生理水平过高与炎症［2］、白癜风［3］等疾病相关.体内H2O2原位直接检测有望实现相关疾病的早期诊断.但由于H2O2的反应性高和半衰期短［4-5］，发展高灵敏、无损（微创）的原位检测技术仍面临巨大挑战.迄今为止，对于H2O2的检测包括分光光度法［6-7］、荧光法［8-9］、比色法［10］和电化学方法［11-12］，这些方法在体内的原位检测过程中，仍存在掩蔽剂的残留和需要破坏生物组织结构的问题.同时H2O2衰减速度过快，导致这些方法的原位检测仍然存在困难.

基于金纳米粒子（Au NPs）和银纳米粒子的表面增强拉曼（SERS）技术因具有灵敏度高、可实时检测的优点，已在生物传感器中获得应用［13］.但是在SERS的检测过程中，纳米粒子在生物组织中的不稳定聚集会引起信号的差异，而纳米粒子的残留问题仍难以解决［14］.同时，在生物组织深度信息检测中，SERS还存在检测深度不足的问题［15］.

微针（MNs）是一种微创技术，最初的目的是用于透皮给药.本研究利用了高机械强度和高透光率的聚甲基丙烯酸甲酯微针（PMMA-MNs），其高机械强度能够穿透皮肤屏障；同时，高透光率解决了SERS检测深度不足的问题，能够进行原位检测［16］.这种将MNs技术与SERS结合的思路也解决了纳米粒子的残留与信号不均匀的问题.在PMMA-MNs上修饰聚多巴胺（PDA）层，利用PDA的黏附性，能够在PMMA-MNs上修饰纳米粒子，同时其与离心技术的结合大大缩短了纳米金@聚多巴胺@微针（Au@PDA@MNs）基底的构建时间.随后，4-巯基苯硼酸（4-MPBA）被成功修饰在Au@PDA@MNs基底上，在H2O2的环境下，4-MPBA失去硼酸基团转变为4-羟基苯硫酚（4-HTP）［17］，从而引起SERS信号的变化，如图1所示.1 000 cm-1和1 068 cm-1处拉曼信号强度比值（I1000/I1068）被用来检测H2O2的浓度［18］.最后，以离体猪皮为检测对象，通过加标的方式成功在猪皮内检测出H2O2的浓度.这种原位检测策略为临床疾病的早期诊断提供了新平台，同时也为SERS光谱在生物医学上的应用提供了新思路.

图1 H2O2敏感探针检测H2O2的示意图.

1 实验部分

1.1 主要试剂

四水氯金酸（HAuCl4·4H2O）、柠檬酸三钠（Na3Cit）、盐酸多巴胺（DA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris·HCl）、30%H2O2、4-MBPA、4-HTP均购于阿拉丁（上海）有限公司；葡萄糖、罗丹明6G（R6G）、唾液酸、次氯酸钠（NaClO）、2，2-偶氮二（2-甲基丙脒）二盐酸盐（AAPH）均购于麦克林生物科技.光可交联的甲基丙烯酸甲酯（MMA）由Esun（中国深圳）公司提供.所有药品均为分析纯，实验过程所需水都是使用的超纯水.

1.2 主要仪器

S-4800型场发射扫描电子显微镜（FE-SEM），上海日立公司；紫外-可见分光光度计（UV-7504PC），上海欣茂仪器有限公司；离心机（H1650），湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Thermo DXR2xi，U.S.A.，激发光波长633 nm，激光功率为4.0 mW，曝光时间为0.05 s，扫描次数为500次.

1.3 PMMA-MNs的制备

将MMA溶液倒入聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中，真空脱气，紫外光照射1.5 min后，将聚甲基丙烯酸甲酯-微针（PMMA-MNs）从PDMS模具中分离出来.阵列中的每个MNs高度为450 μm，底部直径为250 μm.

1.4 Au NPs的制备

Au NPs的制备参考LEE等［19］的方法：1 mL 1%（质量分数）的HAuCl4·4H2O加入到100 mL超纯水中，搅拌煮沸后加入1.5 mL 1%（质量分数）的Na3Cit.搅拌煮沸30 min后停止加热，搅拌冷却至室温，最后4℃冷藏待用.

1.5 H2O2敏感探针的构建

将PMMA-MNs用乙醇洗去未反应的单体，0.02 g的多巴胺溶解在10 mL的Tris-HCl溶液中，随后将洗净后的PMMA-MNs浸泡在多巴胺溶液中，2 h后取出冲洗干净备用.在包覆PDA的PMMA-MNs中加入1 mL的Au NPs，控制离心转速4 000 r·min-1，离心时间5 min，最后将制备好的Au@PDA@MNs洗净备用.

称取0.05 g的4-MPBA和0.05 g的4-HTP分别溶解在10 mL的乙醇溶液中备用，随后取1 mL上述溶液加入到Au@PDA@MNs基底中，反应30 min后取出用超纯水洗净备用.

1.6 离体猪皮内的H2O2的检测

取一块1 cm×1 cm的离体猪皮样品，将其浸入100 μmol·L-1的H2O2溶液中，30 min后取出，用超纯水将表面的H2O2洗净，干燥后备用.随后将制备好的H2O2敏感探针插入猪皮中，让其反应5 min后获得SERS光谱.原始SERS光谱被导入LabSpec5软件，并使用Savitzky-Golay卷积算法进行平滑.

2 结果与讨论

2.1 Au@PDA@MNs的构建和表征

合成的Au NPs的紫外吸收光谱如图2（a）所示，在522 nm处表现强的吸收峰，表明合成的Au NPs的粒径大约为40 nm［20］.Au@PDA@MNs的FE-SEM放大图也证实了Au NPs的粒径大小，如图2（b）所示.利用PDA的黏附性和控制离心转数、时间可以在MNs表面成功修饰Au NPs，并且可以避免Au NPs的团聚，原因可能是这种离心力克服了Au NPs、PDA以及纳米粒子之间的静电斥力；同时，Au NPs和PDA的黏附力克服了Au NPs的重力.图2（c）的能谱分析（EDS）图也证实了Au@PDA@MNs的成功制备.随后，以R6G为拉曼信号分子，研究了Au@PDA@MNs的SERS增强效果，证实了Au@PDA@MNs的SERS增强效果，如图2（d）所示.

图2 Au@PDA@MNs的表征.（a）Au NPs的紫外吸收光谱图（最大吸收峰在522 nm）；（b）Au@PDA@MNs的FE-SEM图；（c）Au@PDA@MNs的EDS图；（d）Au@PDA@MNs的拉曼光谱图（10-5 mol·L-1的R6G作为拉曼信号分子）

2.2 Au@PDA@MNs的条件优化

分别控制加入的Au NPs的量、离心的转速和离心的时间，研究Au@PDA@MNs的SERS增强效果，3种条件优化的拉曼光谱图如图3（a）～3（c）所示.当Au NPs加入量为1 mL时，SERS信号最好，如图3（d）所示.离心的时间为5 min时的SERS信号最佳，如图3（e）所示.图3（f）表明当离心转数为4 000 r·min-1时，SERS信号最佳.其原因可能是随着加入Au NPs量过多、转速过快或离心时间过长，会引起更多纳米粒子的团聚，纳米粒子之间的距离过近，导致有效热点数目降低；加入的Au NPs量过少、转速过慢和离心时间过短，纳米粒子间的距离变远，有效热点数目不足［21］.结果表明：Au@PDA@MNs的制备过程中控制Au NPs加入量为1 mL、离心转速为4 000 r·min-1、离心时间为5 min时的SERS信号最佳.

图3 不同（a）Au NPs的加入量、（b）离心的时间和（c）离心的转速的拉曼光谱图（10-5 mol·L-1的R6G作为拉曼信号分子），以及不同（d）Au NPs的量、（e）离心时间和（f）离心转速对1 510 cm-1处SERS的影响

2.3 Au@PDA@MNs的SERS性能考察

由于Au@PDA@MNs的SERS性能影响着检测的灵敏度，因此考察优化后的Au@PDA@MNs的SERS性能很有必要.如图4所示，以不同物质的量浓度的R6G作为拉曼信号分子，研究了Au@PDA@MNs的灵敏度，结果表明：Au@PDA@MNs在10-4～10-8mol·L-1的范围内有良好的线性响应，其检测限（LOD）为3.1×10-10mol·L-1.

图4 Au@PDA@MNs在不同物质（CR6G）的量浓度的R6G下的（a）拉曼光谱图和（b）校准曲线

2.4 H2O2敏感探针的构建

通过将4-MPBA修饰在Au@PDA@MNs上，成功构建了H2O2敏感探针.如图1所示，其在997 cm-1和1 011 cm-1处的2个峰归因于B—O的对称伸缩和B—O—H在硼酸上的变形振动［18］.在1 068 cm-1和1 562 cm-1处的另外2个峰被指定为苯环上C—H的平面变形和苯环上C＝C的伸缩振动［17］.随后，将4-HTP也修饰在Au@PDA@MNs上，研究了4-MPBA与4-HTP的变化情况，其1 000 cm-1归因于C—C和C—C—C的拉伸振动［22］.在H2O2的环境下，4-MPBA会失去硼酸基团，转变为羟基基团，从而引起997，1 011和1 000 cm-1拉曼峰位和峰强的变化，因此，1 000 cm-1和1 068 cm-1处拉曼信号强度比（I1000/I1068）的变化可用于定量检测H2O2的浓度.

2.5 H2O2敏感探针原位检测

分别配制10，100，500，1 000和2 000 μmol·L-1的H2O2溶液，研究了H2O2敏感探针的检测性能.如图5所示，H2O2敏感探针的校准曲线为y=0.000 06x+0.113，范围在10～2 000 μmol·L-1内有响应，其LOD为0.93 μmol·L-1.随后，分别研究了1 000 μmol·L-1的ClO-、NO、·OH、葡萄糖、葡萄糖酸和谷胱甘肽对H2O2敏感探针检测的干扰.图6表明这些物质对H2O2检测干扰较小，原因可能ClO-、NO、葡萄糖酸和谷胱甘肽具有还原性，无法与硼酸基团发生反应.相比于H2O2，葡萄糖的氧化性较弱，正如文献报道一样［17］，氧化性较强的·OH干扰也较小.最后，以离体猪皮作为检测对象，将H2O2敏感探针小心插入猪皮，反应5 min后采取SERS数据.如图7所示，加标后H2O2敏感探针的SERS比值为0.12，由校准曲线可知，检测的H2O2的物质的量浓度为117 μmol·L-1，结果基本准确，说明H2O2敏感探针可以很好地用于H2O2的原位检测.不仅如此，通过修饰其他拉曼活性反应物，这种MNs型SERS基底可以作为原位检测平台，用于其他生物标志物和生理生化指标的原位微创检测.

图5 H2O2敏感探针检测不同浓度的H2O2.

图6 各种干扰物质（1 000 μmol·L-1）对H2O2敏感探针的SERS响应的（a）影响及（b）干扰程度

图7 加标100 μmol·L-1的H2O2溶液后（a）空白和加标离体猪皮的拉曼光谱图；（b）空白和加标离体猪皮的I1 000/I1 068的值（***表示p＜0.001，有显著差异）

3 结论

基于高透光率和高机械强度的PMMA-MNs，利用PDA的黏附性在MNs表面修饰Au NPs，成功构建了Au@PDA@MNs SERS基底，离心技术的结合大大缩短了Au@PDA@MNs SERS基底的构建时间.研究发现，在加入的Au NPs量为1 mL、离心转速为4 000 r·min-1和离心时间为5 min时，SERS增强效果最佳.以R6G为拉曼信号分子，Au@PDA@MNs的检测线性范围为10-4～10-8mol·L-1，LOD为3.1×10-10mol·L-1.在Au@PDA@MNs基底上修饰4-MPBA后成功构建了H2O2敏感探针，用I1000/I1068的SERS强度比值可定量检测H2O2的物质的量浓度.其线性范围为10～2 000 μmol·L-1，LOD为0.9 μmol·L-1.最后，以离体猪皮作为检测对象，加入100 μmol·L-1的H2O2溶液，通过将H2O2敏感探针插入猪皮中，反应5 min后测定SERS光谱图，其I1000/I1068的比值表明其物质的量浓度为117 μmol·L-1，检测结果与加标浓度基本一致.这种将激光透明的MNs和SERS技术结合的思路，为将来体内生理和病理变化的原位检测提供新平台，也为未来的临床疾病的早期诊断提供新的思路.