基于金纳米线构建电化学传感器间接检测碱性磷酸酶活性

余婷婷，王 敏，文 颖，杨海峰

（上海师范大学化学与材料科学学院，上海 200234）

0 引言

碱性磷酸酶（ALP）是一类可催化磷酸单酯水解为无机磷酸盐的酶，可以特异性识别多种底物分子［1-3］.ALP几乎存在于所有生物体，在骨骼、肝、肾、肠和胎盘［2，4］等各种组织中都可以发现调节磷酸化相关的生化行为，并且ALP是常规临床测试中最常检测的酶之一［1］.研究证明ALP与乳腺癌、前列腺癌、肝功能不全、骨病和糖尿病等许多疾病密切相关，因此ALP可以作为诊断此类疾病的重要生物标志物［5-6］.开发简单且灵敏的方法来分析检测ALP的活性至关重要.

近年来，已开发出多种方法来测定ALP的活性，包括荧光法［7］、电化学方法［8］、比色法［9］和表面增强共振拉曼散射法（SERRS）［10］等.例如，WANG等［11］开发了基于聚阳离子诱导的非共价苝探针自组装的ALP活性测定的无标记荧光开启策略.ZHU等［12］设计了一种无标记发夹型荧光生物传感器，通过氧化石墨烯设计传感器来检测ALP活性.尽管上述检测方法具有其自身的优势，但仍需要精密的光学仪器，这限制了它们在实际ALP活性测定中的应用.相比于光学方法，电化学方法具有响应速度快、灵敏度好、成本低，以及可微型化的显著优势，并已被用于ALP活性的检测［13］.例如，SERRA等［14］通过使用电流型石墨-特氟隆复合酪氨酸酶生物传感器实现了ALP的快速监测.然而，这种电化学方法需要固定化电极表面上的DNA探针或去磷酸化底物，以及其他用于构建电化学生物传感器的繁琐过程.因此，迫切需要开发更简单、更快速的无固定化电化学方法来测定ALP活性.

贵金属（特别是金）因为其独特的光、电、催化等方面的优势，使贵金属纳米材料成为众多领域的研究热潮.金纳米颗粒的低电阻率和化学惰性以及特殊的表面等离子共振（SPR）效应让一维的纳米结构备受研究者关注.近几年，金纳米线（AuNWs）在合成方法上的发展取得了重大突破，如经常使用的模板法和湿化学方法.在模板法里又可以分类为硬模板法和软模板法，例如有以DNA为模板［15］，还有以多孔阳极氧化铝和介孔二氧化硅（SiO2）为模板［16］.虽然模板法的优势是操作简单、产率高和低成本，但是制备的产物AuNWs如何与模板成功分离一直未得到很好的解决.在湿化学方法中有种子调控生长法［17］和有机溶剂合成法［18］.其中，种子调控法分为种子制备和生长溶液制备两个过程，该方法被广泛应用于金纳米棒的制备.

本文作者设计了一种无标记的电化学传感器间接检测ALP，在金纳米线/氧化铟锡（AuNWs/ITO）导电玻璃电极上组装上铜离子（Cu2+），利用焦磷酸根阴离子（P2O74-，PPi）可以竞争性结合Cu2+，使其电化学信号降为稳定值，由于PPi是ALP的底物，加入ALP后，PPi水解，Cu2+被释放出来，使电极表面Cu2+信号上升，通过Cu2+的信号可间接定量ALP的活性.构建的Cu2+-AuNWs/ITO传感器可以用来选择性定量检测ALP活性.

1 实验部分

1.1 实验仪器

CHI660C电化学工作站（中国上海晨华仪器有限公司）；电化学检测是标准的三电极系统：AuNWs/ITO作为工作电极，铂（Pt）丝作为惰性辅助电极，饱和甘汞电极（SCE）作为参比电极；采用CHI660D在物质的量浓度均为5.0 mmol·L-1的铁氰化钾/亚铁氰化钾（K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］），包含0.1 μmol·L-1氯化钾（KCl）的电解质溶液中记录不同电极的阻抗谱图.场发射扫描电子显微镜（FE-SEM，Hitachi S-4800）；能谱能量色散型X射线荧光光谱仪（EDX，JSM-6700F）；X射线衍射仪（XRD，D/Max-2000 VPC）.

1.2 实验试剂

四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O）、三水柠檬酸三钠、硫酸（H2SO4）、双氧水（H2O2）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，质量分数≥98%）、4-巯基苯甲酸（4-MBA，质量分数≥99%）、磷酸盐缓冲溶液（PBS）和抗坏血酸（AA）均为分析纯，购于Sigma-Aldrich公司.丙酮、异丙醇和乙醇均为分析纯，购于Adamas公司.磷酸氢二钠（Na2HPO4）、硝酸铜、焦磷酸钠、硫酸镁、氯化钾和氯化钙均为分析纯，购于Shanghai Richjoint Chemical Reagents公司.三磷酸腺苷（ATP）、ALP、血红蛋白、牛血清蛋白和葡萄糖氧化酶均购于麦克莱恩生物技术公司.所有化学品都直接使用，没有任何进一步纯化.整个实验所用溶液均用去离子水（电阻率为18.25 MΩ·cm）制备.

1.3 修饰电极的制备

1.3.1 金纳米溶胶的制备

将装有100 mL去离子水的锥形瓶置于磁力搅拌器上，然后量取0.1 mol·L-1HAuCl4于瓶中，加热至微沸状态，最后滴加2.0 mL，质量分数为1%的柠檬酸三钠.几分钟后观察到AuNPs的形成，溶液从淡黄色变为无色，再变成红色［19］.

1.3.2 AuNWs/ITO电极的制备

依次使用丙酮、异丙醇和去离子水对ITO玻璃超声10 min，再在80℃下烘干1 h.将ITO玻璃切成面积为1 cm×1 cm的小板.然后，将上述ITO板先用食人鱼溶液（体积比为V（H2SO4）∶V（H2O2）=7∶3）处理30 min，以形成带有羟基的亲水表面.将处理过的ITO板浸入3-氨基丙基三乙氧基硅烷/乙醇（APTES/EtOH）溶液（体积比为V（APTES）∶V（EtOH）=5∶100）中2 h，以进行氨基的改性，用乙醇和水清洗ITO玻璃3遍及以上，以去除过量的APTES.将氨基改性的ITO板在含有金种子的溶液中浸泡1 h，用水洗涤以除去过量的金种子.最后，将组装金种子的ITO放入乙醇/水溶液（体积比为V（EtOH）∶V（H2O）=3∶1），包含1.6 mol·L-1HAuCl4和0.01 mol/L 4-MBA溶液中，并加入0.1 mol·L-1AA溶液作为还原剂，以制备AuNWs.用乙醇冲洗最终产物，即获得AuNWs/ITO，并用氮气（N2）吹干.

1.3.3 制备Cu2+-AuNWs/ITO电极

将制备好的AuNWs/ITO电极放入一定浓度的Cu2+溶液进行自组装1 h，然后用蒸馏水洗去结合不牢固的Cu2+，重复操作3次，并在N2吹干后置于室温保存.

1.4 ALP电化学检测机理

利用Pt丝电极、饱和甘汞电极、Cu2+-AuNWs/ITO电极作三电极系统完成ALP（30～60 units·mg-1）的电化学检测.首先，将Cu2+-AuNWs/ITO电极置于一定浓度的PPi溶液中，此时Cu2+电化学信号会下降到稳定；再向PPi溶液中加入分装好的不同浓度的ALP时，由于ALP水解其底物PPi，并释放出Cu2+，此时电化学信号又上升；最后，根据Cu2+的信号来间接检测ALP的活性，如图1所示.

图1 Cu2+-AuNWs/ITO复合传感器的检测原理示意图

2 结果与讨论

2.1 Cu2+-AuNWs/ITO电极的形貌表征

组装在AuNWs/ITO电极后仍能看到AuNWs均匀分布在电极表面，图2是制备的Cu2+-AuNWs/ITO电极的SEM图，可以看出当Cu2+的组装不影响AuNWs的形貌，组装原理是Cu2+可以跟AuNWs/ITO电极上的4-MBA螯合.从图2（d）～2（f）中可以看出Au、硫（S）和Cu元素均匀分布在电极表面，但Cu2+含量较少，原子含量低于0.1%.

图2 Cu2+-AuNWs/ITO的形貌和元素含量表征.

2.2 不同修饰电极的电化学表征

为了验证传感器成功组装上Cu2+，分别获得了裸ITO，AuNWs/ITO和Cu2+-AuNWs/ITO在0.1 mol·L-1三羟甲基氨基甲烷盐盐酸（Tris-HCl）（pH=6.0）中的循环伏安图，扫描速率为50 mV·s-1，如图3所示.裸ITO和AuNWs/ITO电极在Tris-HCl中无显著的氧化还原峰，而Cu2+-AuNWs/ITO电极可以观察到在0.3 V左右的氧化峰和0.1 V左右的还原峰，这是因为Cu2+在电极表面发生了氧化还原，证明Cu2+组装成功.

图3 裸ITO，AuNWs/ITO和Cu2+-AuNWs/ITO在0.1 mol·L-1 Tris-HCl（pH=6.0）中的循环伏安图（扫描速率为50 mV·s-1）

2.3 实验条件的优化

为了提高Cu2+-AuNWs/ITO传感的检测选择性和灵敏度，对AuNWs的生长时间、Cu2+的物质的量浓度、PPi的物质的量浓度、Cu2+与PPi的反应时间和pH进行了优化.

考察了该体系中AuNWs生长时间和不同Cu2+物质的量浓度（10，75，250，500和750 μmol·L-1）的影响，如图4（a）所示.结果表明：在生长时间为70 min时，制备的Cu2+-AuNWs/ITO电极在Tris溶液中响应最好，所以选择70 min作为最优时间.当组装时Cu2+浓度增加，电极电流响应逐渐变大，但当增加到一定程度时保持不变，这是因为AuNWs/ITO电极上修饰的4-MBA达到饱和，所以其可以与一定浓度Cu2+螯合.最终选择组装Cu2+的物质的量浓度为500 μmol·L-1，如图4（b）所示.

图4（c）和（d）显示了在不同物质的量浓度（0，1，5，10，25和50 μmol·L-1）PPi溶液中制备的Cu2+-AuNWs/ITO电极的电化学响应.从图4（c）的微分脉冲伏安法（DPV）图可以清晰地看出随着PPi物质的量浓度的变化，峰值也随之变化.而图4（d）中可以观察到随着PPi溶液物质的量浓度的增加，Cu2+的电化学响应逐渐减小，这是因为PPi可以竞争性结合Cu2+导致电化学信号下降，考虑到后续实验，选用最优条件为50 μmol·L-1.

进一步考察了Cu2+与PPi溶液孵育时间，结果显示时间在0～20 min内信号一直处于下降趋势，到30 min以后基本保持不变，证明Cu2+-AuNWs/ITO电极上的Cu2+被PPi竞争下来需要一定时间，如图4（e）所示.最后选择30 min为最佳孵育时间.考察了制备的Cu2+-AuNWs/ITO电极在pH为4.0～8.0区间内的峰值电流变化，如图4（f）所示.随着pH逐渐增加，Cu2+峰电流先增加后下降.因此，选择6.0选为最优pH.加入一定浓度ALP水解PPi后，随着孵育时间的延长峰电流也增加，说明ALP水解程度也在增加，40 min达到最大值.

图4 氧化电流随制备Cu2+-AuNWs/ITO的条件变化图.（a）不同AuNWs生长时间和（b）不同物质的量浓度（10，75，250，500和750 μmol·L-1）Cu2+的电化学响应；（c），（d）不同物质的量浓度（0，1，5，10，25和50 μmol·L-1）PPi溶液的电化学响应；（e）不同的Cu2+和PPi孵育时间制备的传感器的性能；（f）不同pH值下Cu2+-AuNWs/ITO的峰电流值响应图

2.4 对ALP活性的线性考察

在最佳检测条件下，通过DPV研究了Cu2+-AuNWs/ITO电极对ALP活性检测的分析性能.如图5（a）所示，当逐渐增大ALP的单位浓度，DPV电流响应值逐渐增大.图5（b）为相应的标准线性图，可以看出基于Cu2+-AuNWs/ITO的传感器，在ALP单位浓度为60～180 U·L-1范围内线性响应良好，线性回归方程可以表示为：I=0.37CALP（其中，I表示不同ALP的单位浓度下的电流密度，单位为μA；CALP表示ALP的单位浓度，单位为U·L-1；相关系数R2=0.998），检测限为12.75 U·L-1.与其他文献中利用荧光法［20］测定的线性范围（1～50 U·L-1）相比，该传感器线性范围更宽，说明基于Cu2+-AuNWs/ITO的ALP传感器具有优异的性能.

图5 Cu2+-AuNWs/ITO电极对ALP活性检测的分析性能图.（a）Cu2+-AuNWs/ITO电极在不同单位浓度的ALP的DPV响应图（从黑色到绿色的曲线分别为0，60，80，100，120，140，160，180和200 U·L-1）；（b）DPV峰值电流与ALP单位浓度的校准曲线图（I0表示空白对照的电流密度）

2.5 传感器的抗干扰性考察

由于在实际样品的检测过程中常存在其他活性物质的干扰，因此需要对制备的传感器进行抗干扰能力的实验.在0.1 mol·L-1Tris-HCl溶液中分别加入50 μmol·L-1PPi，以及物质的量浓度均为500 μmol·L-1的磷酸一氢根（H2PO4

-）、磷酸二氢根（HPO4

2-）和磷酸根（PO43-），电化学响应图如图6（a）所示.可以看出，H2PO4-，HPO42-和PO43-的存在不会明显竞争Cu2+，所以同类磷酸盐干扰较小，其原因可能是Cu2+可以与焦磷酸根离子形成螯合物且结合常数大（结合常数为12.45）.在特定底物为PPi的条件下，不同类的干扰物质的影响如图6（b）所示，干扰物分别为葡萄糖氧化酶（GOx，500 U·L-1）、血红蛋白（Hb，1 μmol·L-1）、牛血清蛋白（BSA，1 μmol·L-1）、ATP（1 μmol·L-1）、镁离子（Mg2+，0.1 mmol·L-1）、钙离子（Ca2+，0.1 mmol·L-1）和钾离子（K+，0.1 mmol·L-1），结果显示干扰物的信号远低于ALP（200 U·L-1），证明ALP对PPi的催化作用是有专一性的.

图6 抗干扰实验图（.a）PPi和磷酸盐相关阴离子（H2PO4-，HPO42-和PO43-）在Cu2+-AuNWs/ITO上的电化学响应；（b）其他干扰物（GOx，Hb，BSA，ATP，Mg2+，Ca2+和K+）的影响

2.6 实际样品的分析检测

为了考察基于Cu2+-AuNWs/ITO的传感器在血清样检测中的可靠性，通过测定加标回收率对稀释后血样中的ALP活性进行检测，回收率在100.9%～101.0%，相对标准偏差（RSD）为1.3%～4.8%.结果表明制备的传感器可成功分析样品中ALP活性.

3 结论

本研究构建了一种基于Cu2+-AuNWs/ITO的传感器用于间接无标记定量测定ALP.利用PPi竞争性结合Cu2+使其电化学信号降为稳定值，通过ALP对底物PPi的水解释放Cu2+恢复电化学信号，既利用了酶的专一性又实现了无标记检测酶的活性.制备的Cu2+-AuNWs/ITO无标记传感器抗干扰性良好，对ALP活性检测范围为60～180 U·L-1，可用于实际血清样品中ALP加标检测，并能获得较好的回收率.