钙黏蛋白5驱动内皮细胞特异性过表达Dickkopf 1影响骨形成

尹一佳 杨瑾廷 申建琪 黄凌依 井岩 官秋玥 韩向龙

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院正畸科 成都 610041；

2.山西医科大学汾阳学院 吕梁 032299；

3.美国德克萨斯州农工大学贝勒牙科学院 达拉斯 TX 75246；

4.四川省人民医院草堂病区老年病房 成都 610072

Dickkopf 1（DKK1）在1998年被报道，其定义为诱导头部形成的关键分泌蛋白[1-2]。DKK1是DKK家族成员之一，目前对其的研究最为透彻，它是Wnt/β-catenin通路的天然拮抗剂[3]。当DKK1与细胞膜上低密度脂蛋白受体相关蛋白（low density lipoprotein receptor related protein，LRP）5/6结合将干扰Wnt-LRP5/6-Frizzled复合物的形成，进而阻断Wnt/β-catenin通路。DKK1可与LRP5/6的β-螺旋1结合阻断Wnt1信号通路，也可与β-螺旋3结合阻断Wnt3a信号通路[4]。

Wnt/β-catenin通路调控细胞关键功能，包括细胞生长、分化和死亡。Wnt/β-catenin通路是骨量的主要调控通路，Wnt信号增强通过以下几种途径刺激骨形成，包括促进成骨细胞分化，阻止间充质干细胞的成软骨和成脂向分化；提升成骨细胞生长速度，抑制其凋亡；抑制破骨细胞生成。DKK-1作为Wnt信号通路抑制剂，其阻断可促进骨保护素（osteoprotegerin，OPG）的表达[5]。

由于DKK1对Wnt信号通路的调控作用，它已被证实作用于多种骨疾病，如骨关节炎、股骨头坏死、骨质疏松等[6-7]。DKK1主要表达于成骨细胞和骨细胞[8]。DKK1敲除小鼠缺乏大部分颅骨结构，出现肢体畸形和出生时死亡。DKK1单倍不足小鼠能够存活，表现为骨量增加，骨小梁数目厚度增加、间隙减少，成骨细胞数目增多，但破骨细胞数目无明显差异[9]。成骨细胞系DKK1过表达小鼠表现为前肢畸形、脱毛和骨质缺乏。敲除成熟骨细胞中DKK1的表达，小鼠呈现骨量增加的表型[10]。以上研究表明DKK1是生理性骨量调节因子，也是导致病变坏死的促进因子。然而DKK1在股骨和牙槽骨中的表达情况及功能尚未明确[11]。

血管不仅具有循环运输功能，还提供血管内分泌信号调控周围器官生长和稳态。在微环境中，这些发挥功能的血管内皮细胞具有高度特异性，然而其具体调控尚未明确[12]。近年来，骨和血管偶联是热门研究方向，血管会影响新骨形成[13]。然而，对骨骼血管的组织分布和精确功能理解也不透彻。因此，研究偶联骨形成和血管形成的因子非常重要。虽然DKK-1在内皮细胞中表达水平较低[14]，研究发现DKK1在血管形成中也发挥作用[15]。在肿瘤发生发展中，DKK1可以促进血管祖细胞的动员，从而导致局部新生血管增加，可能加速肿瘤的发展[16]。在动脉粥样硬化中，DKK1可影响血小板介导的内皮细胞的激活和动脉粥样硬化病变[17]。

然而，DKK1在血管形成中的具体作用仍存在争议[18]。有研究[19-20]发现，人脐静脉内皮细胞分化过程中DKK1表达上调，DKK-1可增加内皮细胞前体细胞成血管活性，沉默DKK1可抑制该细胞成血管能力。另有研究[21]发现，Tie-2驱动内皮细胞过表达DKK1小鼠有严重的血管缺陷，内皮细胞敲除DKK1则可造成软骨缺损。不同的研究结果可能与细胞培养及动物模型不同有关，因此构建更具特异性的内皮细胞驱动的DKK1过表达转基因小鼠有望阐明DKK1在血管形成中的生物学功能。钙黏蛋白5（Cadherin 5，Cdh5）为基因表达的钙依赖性细胞黏附分子。Cdh5特异性在内皮细胞和造血细胞中表达，与血管通透和成血管相关，因而Cdh5-Cre小鼠广泛用于内皮细胞相关研究。

本研究拟构建Cdh5驱动的内皮细胞过表达DKK1的转基因小鼠，检测DKK1体内内皮细胞过表达对股骨和牙槽骨骨形成和血管形成的影响。

1 材料和方法

1.1 Cdh5驱动的内皮细胞特异性过表达DKK1转基因小鼠模型

将Cdh5驱动的转基因小鼠（B6.FVB-Tg(Cdh5-Cre)7Mlia/J，简 称Cdh5-Cre）和 过 表 达DKK1转基因小鼠（R26-DKK1）杂交，获得Cdh5驱动的内皮细胞特异性过表达DKK1转基因纯合子小 鼠（Cdh5-Cre;R26-DKK1/R26-DKK1，简 称DKK1 Tg）。DKK1 Tg作为实验组（n=5），Cdh5-Cre小鼠作为对照组（n=5），8周龄，质量（20±5）g，过量麻醉后颈椎脱臼处死收样。Cdh5-cre与R26-DKK1小鼠由美国德克萨斯州农工大学贝勒牙学院冯健全教授馈赠。

1.2 组织准备和组织学分析

将小鼠下颌骨及股骨以甲醛-硫酸锌溶液（Sigma公司，美国）固定，10%~20%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetra acetic acid，EDTA）溶液脱钙后脱水石蜡包埋。5 μm矢状面切片后行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphate，Trap）染色（Sigma公司，美国）、免疫组织化学染色［DKK1、胶原蛋白collagen（Col）Ⅳ（Abcam公司，英国）］。染色后使用中性树胶封片后采图，使用Image J 8.1分析。

1.3 微型CT（Micro-CT）扫描

将小鼠下颌骨和股骨样本以甲醛-硫酸锌溶液固定，70%乙醇暂存后行Micro-CT扫描，从股骨生长板开始向下延伸50层（厚0.5 mm）划分为股骨感兴趣区域（region of interest，ROI）；第一磨牙根分叉以下80层牙槽骨区域划分为下颌骨ROI，使用SCANCO vivaCT 80分析骨体积（bone volume，BV）、组织体积（tissue volume，TV）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨皮质厚度（cortical thickness，Ct.Th）、骨矿化密度（bone mineral density，BMD）等指标。

1.4 统计学分析

结果表示为均值±标准差（mean±SD），检验水准（α=0.05）。使用Graphpad Prism 8.0行方差分析和作图。

2 结果

2.1 DKK-1 Tg转基因鼠在股骨和牙槽骨高表达DKK1

免疫组织化学染色显示，DKK1 Tg股骨（图1A）和下颌骨牙周膜（图1B）DKK1的表达明显高于对照组，证实Cdh5驱动的内皮细胞细胞过表达DKK1模型构建成功。

图1 DKK1 Tg小鼠股骨和牙槽骨DKK1表达情况Fig 1 Expression of DKK1 in femur and alveolar bone of DKK1 Tg mice

2.2 Cdh5驱动内皮细胞特异性过表达DKK1可增加骨量

Micro-CT扫描分析结果显示，DKK1 Tg股骨生长板下方骨小梁BV、TV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th值增大；BMD、Ct.Th值差异无统计学意义，提示骨小梁及骨量增加，但矿化程度无明显变化（图2A）；牙槽骨BV、TV、BV/TV较对照组增大，骨量增加，而BMD差异无统计学意义，提示牙槽骨骨矿化程度未发生明显变化（图2A）。HE染色显示，DKK1 Tg股骨远心端生长板下方骨小梁密度增加，中央骨髓腔缩窄；生长板上方、关节软骨下方的骨髓腔也明显缩窄；生长板宽度较对照组明显增宽，生长板中成串纵列并行排列的同源细胞群核小，呈椭圆形，肥大软骨细胞层明显增厚（图2B）。

DKK1 Tg牙槽骨骨量有所增多，松质骨间可见髓腔缩窄（图2C），HE染色进一步验证了Micro-CT结果。

图2 DKK1 Tg小鼠股骨及牙槽骨形态学和骨量改变Fig 2 Morphology and bone volume changes in DKK1 Tg mice

2.3 DKK1 Tg转基因鼠在股骨中高表达DKK1，破骨活性减少

DKK1 Tg股骨远心端软骨-骨界面，破骨阳性细胞染色阳性细胞个数减少，提示在DKK1 Tg股骨远心端破骨活性降低，对软骨基质的吸收降低（图3）。

图3 DKK1 Tg小鼠股骨破骨活性Fig 3 Osteoclast activity in DKK1 Tg mice

2.4 DKK1 Tg转基因鼠在股骨和牙槽骨中高表达DKK1，ColⅣ表达水平升高

DKK1 Tg股骨ColⅣ表达量在生长板中软骨-骨界面和肥大软骨细胞的表达较对照组明显增高（图4A）。DKK1 Tg下颌骨牙周膜中ColⅣ表达也明显高于对照组（图4B）。但股骨和牙槽骨中均未发现血管形成有明显变化（图4）。

图4 DKK1 Tg小鼠Col IV表达情况Fig 4 Expression of Col IV in DKK1 Tg mice

3 讨论

DKK1在骨形成中的作用研究较为深入，可通过调控Wnt信号通路从而调控软骨和骨的发育[22]。DKK1的突变与骨密度和骨折风险相关[23-24]，是多种骨疾病的潜在靶点[25]。由于DKK1主要在成骨细胞和骨细胞中表达，因此骨生物学的研究往往聚焦于DKK1在成骨细胞和骨细胞的功能。血管系统是体循环系统和不同器官环境之间的关键界面，血管形成也是促使骨形成和牙周组织改建的重要基础，因此血管形成和骨形成的偶联机制是骨生物学基础之一。

软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和血管内皮细胞等关键细胞在细胞命运决定、增殖和成熟过程中的协同作用参与软骨和骨的发育及维持骨稳态。前期研究已经明确DKK1在血管形成中可发挥作用。因此，DKK1作为骨形成和血管形成的偶联蛋白，其在血管内皮细胞中的精确功能，以及在骨-血管微环境中的生物学功能亟待研究。

本文构建的Cdh5驱动的内皮细胞特异性DKK1过表达转基因小鼠，主要探究内皮细胞过表达DKK1对股骨及牙槽骨骨形成和血管形成的影响。研究[26]发现，8周龄小鼠股骨远心端生长板较对照组小鼠明显增宽，软骨细胞肥大区也明显增宽，但股骨长度未出现明显缩短；牙槽骨骨量也有一定程度增加。以往研究也发现外源性的DKK1可通过阻断Wnt/β-catenin通路阻碍软骨细胞进展到前肥大阶段，并刺激软骨生理发育的相关因子从而获得健康的软骨表型。因此，该结果进一步印证了DKK1通过内皮细胞调控骨和软骨发育的假说[27]。

在牙周膜中，血管基底膜标记物ColⅣ主要表达在Malassez上皮剩余内皮细胞团周围[28]，张力可刺激牙周膜ColⅣ降解，从而促进血管生成[29]。本研究发现，牙周膜内ColⅣ表达广泛上调升高，但其血管形成未有明显差异。此外，ColⅣ在正常关节软骨细胞周围表达，在钙化软骨中表达量低[30]，但本研究意外发现DKK1在内皮细胞内的特异性过表达引起了软骨细胞内ColⅣ表达水平上调。因此，内皮细胞内DKK1上调介导的ColⅣ表达的机制需要进一步研究。

本研究选用Cdh5构建内皮细胞特异性的Cre重组酶表达。Cdh5又名CD-144和VE-Cadherin，是一种跨膜蛋白，参与内皮细胞间的黏附。Cdh5启动子元件在成年内皮和静息状态的内皮中均有活性[31-32]。其他常用的内皮细胞特异性Cre重组酶表达品系，包括Tie-1-Cre、Tie-2-Cre、PECAM-Cre和Flk-1-Cre。它们各自有其优势和不足。Tie-1-Cre在早期内皮中表达，但Tie-1在造血细胞、皮质和海马体的一些神经元中也表达。Tie-2-Cre，是内皮中应用最多的删除酶系，但在中胚层中也有表达。Flk-1-Cre在肌肉系细胞中也有表达，尽管用限制性片段消除了肌肉表达的影响，但在静息状态的内皮中不能完全渗透。此外，这些启动子的活性大部分在成年鼠静息状态的内皮中不表达[33]。相对于其他内皮细胞特异性表达的系统来说，Cdh5-Cre模型具有一致的血管渗透性，在胚胎和成年后分化的内皮中均具有特异性的基因表达。这一明显的优势，使其在探究成年内皮的生理和病理状态下的功能变化具有重要意义。

以往研究多聚焦于DKK1在内皮细胞系中表达改变对胚胎发育时期的影响[21]，构建的Tie2-DKK1转基因小鼠出现E18.5骨小梁面积和厚度的减小，软骨细胞肥大区域的明显增宽，但骨量无明显变化的表型。本研究聚焦于成年鼠的骨形成变化，发现成年小鼠呈现了与E18.5小鼠的表型相似性。然而，Tie2-DKK1转基因小鼠表现出E18.5和4周的上下肢骨长度变短，而在Cdh5-Cre;R26-DKK1/R26-DKK1小鼠中未发现相似表型，因此具体机制的作用有待进一步研究。

综上，本研究为探究DKK1偶联血管形成和骨形成的作用，构建Cdh5驱动的内皮细胞特异性DKK1过表达转基因小鼠。该小鼠股骨和牙槽骨DKK1高表达，骨量增加，骨髓腔缩窄，股骨破骨细胞减少，股骨和牙槽骨ColⅣ高表达。因此，内皮细胞中DKK1可能对骨形成起调控作用，Cdh5驱动内皮细胞中DKK1表达增加与骨组织中软骨细胞的分化及骨小梁的形成、牙周组织骨量的增加密切相关，DKK1作为骨量和调节因子和血管形成的调控因素，深入研究DKK1具体机制有望阐明在应力刺激下Wnt信号通路对牙槽骨中骨和血管形成的调控作用。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。