香港牡蛎幼虫运动、耗氧率、摄食率及趋光性研究

2022-11-09张兴志官俊良何苹萍张立李蔚马元韦嫔媛彭金霞

南方农业学报 2022年8期

张兴志，官俊良，何苹萍，张立，李蔚，马元，韦嫔媛，彭金霞

（广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁 530021）

0 引言

【研究意义】香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）俗称大蚝，地方名“钦州大蚝”“北海生蚝”等，是我国牡蛎养殖的三大主导品种之一。香港牡蛎肉质鲜美，营养价值高，其中钙含量接近牛奶，素有“海中牛奶”之美称，“钦州大蚝”是广西著名的原产地理标志产品。香港牡蛎目前年产量178.7万t，占全国牡蛎总产量的32.95%，产值170多亿元（农业农村部渔业渔政管理局，2021）。香港牡蛎是我国华南沿海及越南、文莱等“一带一路”国家主要养殖经济贝类品种，对渔民增收、脱贫致富作出了巨大的贡献（张兴志等，2019）。长期以来，香港牡蛎苗种主要来自于海区自然采苗（钟方杰等，2014），广西钦州湾茅尾海曾是我国最大的香港牡蛎天然采苗区（王如才，2004），苗种供应广西、广东及越南等东南亚国家。受场地老化、沿岸工业及城镇化发展的影响，近十几年来广西传统牡蛎采苗场苗种产量低（李坚明和刘坚红，2008），且苗种质量良莠不齐、养殖周期长（2～3年），导致苗种长期短缺。人工孵化苗种应运而生，但苗种产量较低，远远不能满足市场需求，急需开展生产过程可控且绿色高效的香港牡蛎苗种培育技术的研究与探索。因此，研究香港牡蛎幼虫培育过程中的运动速度、耗氧率、摄食率及趋光性等关键参数，对牡蛎人工育苗的集约化、精准化管理具有重要的指导意义。【前人研究进展】明确幼虫的生物学特点，实现贝类苗种高密度、集约化、高效率的苗种生产，是解决苗种紧缺的有效途径。目前，学者们围绕贝类幼虫运动、摄食及趋光性等生物学特性开展了诸多研究。Wheeler等（2013）研究发现，牡蛎幼虫倾向于向上游动，即使是在非常湍急的水流中，幼虫也会向上游动，潜水反应次数减少。Qiu等（2015）研究了福建牡蛎（Crassostrea angulata）幼虫的摄食行为和运动特点，并测定单个幼虫的游泳速度、摄食率等关键参数，以此，构建了牡蛎苗种循环水高密度养殖设施。邓正华等（2016，2018）描述了合浦珠母贝（Pinctada fucata）和珠母贝（Pinctada margaritifera）幼虫的运动行为及摄食行为，并显著提高了育苗效率。Wheeler等（2017）、Meyer等（2018）研究发现，在流水的环境中，光照会显著影响东部牡蛎（Crassostrea virginica）幼虫的游泳速度和游泳方向，同时会改变其螺旋游泳时的角度，且随着其幼虫年龄的增长，幼虫游泳能力降低，倾向于留在水体底部。Zhang等（2021a）研究发现，长牡蛎（Crassostrea gigas）和熊本牡蛎（Crassostrea sikamea）杂交幼虫对特定光强和波长具有趋光性，这种能力不是眼点幼虫所特有，在未发育出眼点的牡蛎幼虫中也存在。【本研究切入点】香港牡蛎幼虫特性及人工育苗技术的研究较少，有学者从盐度及培育密度等方面开展了人工育苗的研究（官俊良，2015），但缺少幼虫培育时期的基础数据，如幼虫的运动、耗氧率、摄食率及光选择性等，在育苗生产实践中，无法实现精准的饵料投喂、溶氧调控及环境调节，导致人工育苗产量始终较低。因此，目前鲜见有关香港牡蛎幼虫运动、耗氧率、摄食率及趋光性的研究报道。【拟解决的关键问题】通过开展香港牡蛎幼虫运动速度、面盘大小、耗氧率、摄食率及趋光性等方面的研究，将香港牡蛎幼虫运动、耗氧率及摄食率等特征与生长特性建立数量化关系，实现对单个幼虫行为的定量化描述，对香港牡蛎人工育苗中幼虫的精准化培育管理、确定幼虫最优饵料投喂量具有指导意义，同时为设施化高密度育苗设施构建提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 幼虫获得及培育

2021年8月，挑选广西北海廉州湾牡蛎养殖区性腺发育成熟的香港牡蛎雌雄亲贝各5只，通过解剖获得精卵后进行人工授精，受精后在500 L养殖槽中孵化以备实验使用，孵化密度10～15 ind/mL，盐度30‰，水温28±1℃，孵化24 h后获得幼虫，即开始投喂饵料。试验所用水为经过2级过滤的砂滤海水，每隔2 d更换一次。金藻最适于牡蛎幼虫的营养需求（Acarli and Lok，2011），因此，在培育期间，幼虫饲喂球等鞭金藻（Isochrysis galbana）（细胞直径4.42±0.60μm，n=30），每天投喂2次饵料，投饵量视幼虫摄食情况而定。人工授精方法、卵的孵化、幼虫收集及幼虫培育参考张兴志等（2019）的描述。

1.2 测定方法

1.2.1 运动速度测定随机选取不同发育时期的幼虫（D形幼虫、前期壳顶幼虫、中期壳顶幼虫、后期壳顶幼虫和眼点幼虫）各30个。在幼虫投喂2 h后，根据不同的规格，选择相应网目的筛绢网，收集幼虫，用吸管将幼虫置于直径为45 mm表面皿中，静置5 min待幼虫适应后，使用莱卡显微镜（DM750）和显微数码测量分析系统记录幼虫运动轨迹。使用视频处理软件逐帧播放，保存幼虫瞬时运动照片，利用图像处理软件Photoshop CC测量幼虫的大小和运动距离，计算运动速度（v）。

1.2.2 面盘直径和壳高测量随机选取4个发育时期的幼虫（D形幼虫、前期壳顶幼虫、中期壳顶幼虫和后期壳顶幼虫）各30个。在盛有幼虫的表面皿中滴入3～5滴50 g/L的MgCl2（终浓度约2～3 g/L），使运动中的幼虫（面盘突出并完全伸展）瞬间麻醉，在40倍显微镜下拍照并测量其面盘直径（d）和壳高。

1.2.3 耗氧率测定使用筛网收集不同发育时期的香港牡蛎幼虫（D形幼虫、前期壳顶幼虫、中期壳顶幼虫和后期壳顶幼虫），将幼虫密度稀释至50～70个/mL，置于5000 mL呼吸瓶内，设3个平行。使用YSI professional水质分析仪测定初始的溶解氧含量，用封口膜封口。呼吸瓶在室内静置，空调保持温度在适宜范围（28℃）内，每隔1 h测定水中溶解氧。为保证幼虫的正常生理活动，试验结束时，舍弃溶氧低于4.5 mg/L的试验组（Zhang et al.，2021b）。同时，设置1组海水对照组（不放置幼虫），消除不可控环境因素产生的影响。单个幼虫耗氧率计算公式：

式中，R为耗氧率（ng/h），V为试验海水的体积（mL），L为幼虫密度（个/mL），DO0和DOt分别为试验开始和试验结束时水体中溶解氧浓度（mg/L），t为试验时间（h）。

1.2.4 摄食率测定在停饲4 h后，分别收集发育至不同时期的香港牡蛎幼虫（D形幼虫、前期壳顶幼虫、中期壳顶幼虫、后期壳顶幼虫和眼点幼虫），将其分别稀释至5～10个/mL，置于1000 mL烧杯内，每种规格设3个平行。投喂球等鞭金藻为饵料，测定摄食率，投喂密度8000～10000 cells/mL，每隔1 h取样，使用血球计数板计数饵料密度。试验过程中微量充气。同时，设置1组海水对照组（投放饵料但不放置幼虫），消除饵料沉降产生的影响。幼虫摄食率计算公式：

式中，F为摄食率（cells/h），V为试验海水的体积（mL），L为幼虫密度（个/mL），C0和Ct分别为试验开始和试验结束时水体中饵料密度（cells/mL），t为实验时间（h）。

1.2.5 光色对香港牡蛎幼虫的诱集效果测定使用自主设计组装的LED光源和彩色纸板作为幼虫诱集光源（图1），光色设置白、红、黄、蓝、紫和绿色等6种，每个色块设置3个重复。光照强度50 Lx（Zhang et al.，2021），将幼虫放置在直径为15 cm的培养皿中，通过不同光色诱集30 min后，用移液枪竖直在不同光色块的中央位置各吸取水样1 mL，计数幼虫数量，然后将幼虫放回培养皿中，旋转培养皿并搅动水体，30 min后再次计数，重复3次取平均值。统计不同光色诱集幼虫的数量，并计算幼虫数量所占比例，以此判断幼虫的趋向性。试验测定了D型幼虫（壳高66.75±4.49μm）、壳顶幼虫（壳高195.43±20.25 μm）和眼点幼虫（壳高302.39±22.38μm）3个时期香港牡蛎幼虫的驱光效应，试验设置幼虫密度约20个/mL。为去除光线干扰，光色试验在20：00后进行。

1.3 统计分析

用Photoshop CC处理图像并绘制幼虫运动轨迹示意图。采用SPSS 19.0对试验数据进行单因素方差分析及相关分析，用Excel 2016作图。

2 结果与分析

2.1 香港牡蛎幼虫的运动速度测量及其与壳高的相关分析结果

不同发育时期香港牡蛎幼虫如图2所示。幼虫运动轨迹如图3所示。幼虫游泳时，双壳张开，面盘凸出壳外，呈椭圆形或近圆形，面盘外周由纤毛组成，形成纤毛环，纤毛不断摆动带动面盘及幼虫运动（图3-A和图3-B）。幼虫运动俯视图如图3-C。通过幼虫运动轨迹发现，在水平方向上，幼虫朝着一定半径的圆形进行顺时针游动（图3-D）。对不同发育时期的幼虫运动视频分析结果显示，香港牡蛎幼虫的运动速度为550～7500μm/s，对应的壳高为68～318μm，幼虫运动速度随壳高增高而增加，但接近变态时，幼虫的平均运动速度则下降。游泳速度（y）和幼虫壳高（x）的相关方程为y=-0.0043x2+27.992x-1002.6，R²=0.9892（图4）。

2.2 香港牡蛎幼虫的面盘直径测量及其与壳高的相关分析结果

不同发育时期香港牡蛎幼虫的面盘大小如图3-A和图3-B。D形幼虫面盘直径最小，为64.34±2.15μm，后期壳顶幼虫面盘直径最大，为276.85±24.42μm。幼虫面盘直径与壳高呈正相关，壳高和面盘直径之间的相关系数为0.98（P＜0.01）（表1），表明二者存在良好的线性关系。幼虫面盘直径（y）和壳高（x）的线性关系为y=0.7867x-11.412，R²=0.9519（图5）。

表1 幼虫壳高与面盘直径的相关系数Table 1 Correlation coefficient between shell height and velum diameter of oyster larva

2.3 香港牡蛎幼虫的耗氧率测定及其与壳高的相关分析结果

不同壳高的香港牡蛎幼虫耗氧率如图6所示。随着幼虫的生长，其个体的耗氧率明显增加，初孵D形幼虫的耗氧率为0.67 ng/h，在即将变态时，单个幼虫耗氧率6.45 ng/h，不同壳高的幼虫耗氧率存在显著差异（P＜0.05）。幼虫耗氧率（y）与壳高（x）的相关方程为y=0.0297x-1.7967，R²=0.9833。

2.4 香港牡蛎幼虫的摄食率测定及其与壳高的相关分析结果

不同壳高的香港牡蛎幼虫的摄食率如图7所示。香港牡蛎幼虫的摄食率随着生长呈先上升后下降的变化趋势。初孵的D形幼虫摄食率最小，为35 cells/h，在进入变态期前，随着幼虫生长，摄食率升高，在平均壳高288μm时，摄食率最大，为660 cells/h。在即将变态时，香港牡蛎幼虫摄食率呈现下降趋势。幼虫摄食率速度（y）与壳高（x）的相关方程为y=-0.0002x3+0.0831x2-10.376x+407.23，R²=0.9933。

2.5 光色对香港牡蛎幼虫的诱集效果

白、红、黄、绿、蓝和紫色等不同光色对香港牡蛎幼虫的诱集结果如表2和图8。不同发育时期幼虫对光色的趋向性不同。白光对D形幼虫的诱集数量最多，即诱集效果最好，其次是蓝光和紫光（表2）。D形幼虫对不同色光趋向性依次为白光［（29.47±5.75）%］＞蓝光［（20.24±7.21）%］＞紫光［（19.94±3.90）%］＞红光（12.65±2.39%）＞绿光［（11.90±2.77）%］＞黄光［（5.80±1.63）%］（图8）。白光、绿光和蓝光对壳顶幼虫诱集数量较多，诱集效果最好（表2），壳顶幼虫对不同光色的趋向性依次为白光［（24.88±7.54）%］＞绿光［（24.10±8.31）%］＞蓝光［（22.05±4.26）%］＞黄光［（10.42±3.25）%］＞紫光［（10.18±1.87）%］＞红光［（8.43±0.74）%］（图8）。蓝光对眼点幼虫的诱集效果数量最多，即诱集效果最好，其次为白光和绿光（表2），眼点幼虫对不同色光的趋向性依次为蓝光［（37.80±4.59）%］＞白光［（19.95±5.33）%］＞绿光［（15.85±2.17）%］＞紫光［（9.93±3.32）%］＞黄光［（9.38±1.25）%］＞红光［（6.92±1.09）%］（图8）。

表2 不同光色诱集不同发育时期牡蛎幼虫的数量Table 2 Number of oyster larva trapped by different light colors

3 讨论

面盘是由担轮幼虫口前纤毛环向外发展，形成具有长纤毛的2个半圆形器官，是双壳贝类幼虫特有的器官（Qiu et al.，2015）。面盘呈近圆形，且可从壳内凸出，其外边缘有纤毛包被（Kraeuter and Castagna，2001）。Blake和Otto（1996）研究发现，福建牡蛎（C.angulata）面盘外周纤毛摆动与钟形虫（Vorticella）类似，纤毛周期性地向同一方向摆动，在带动面盘运动的同时也产生一定方向旋转力，使幼虫沿顺时针方向游动。Le等（2017）研究发现，幼虫通过面盘外周纤毛不断摆动从而形成水流，单胞藻随水流方向运动到幼虫口沟处，在口沟纤毛摆动下部分被捕获。因此，面盘是贝类幼虫重要的运动和摄食器官（Blake and Otto，1996；Qiu et al.，2015）。本研究发现，初孵的香港牡蛎幼虫面盘直径最小，平均值为44.11μm，随着幼虫生长，面盘直径逐渐增加，其范围为44.11～261.11μm，面盘直径与壳高呈正相关关系，与Qiu等（2015）对福建牡蛎幼虫的研究结果相似。面盘等功能器官的快速发育保证了个体早期摄食和运动能力的完善，从而使幼虫获得最适和最大生长效能（贾瑞锦等，2014；高小强等，2018）。

本研究发现，香港牡蛎幼虫通过调节纤毛摆动频率，实现不同的运动形态，包括边摄食边游动、只摄食不游动或快速游动，与珠母贝（邓正华等，2018）的运动形态相似。在本研究中，香港牡蛎幼虫运动速度为550～7500μm/s，且随着幼虫生长，其平均游泳速度逐渐增加，至变态前期有所下降。邓正华等（2018）研究发现，珠母贝幼虫的运动速度为250～3600μm/s。与香港牡蛎幼虫相比，珠母贝幼虫的运动速度更慢，其原因可能是二者幼虫摄食状态不同，双壳贝类幼虫运动状态受摄食的影响（Blanco and Kamermans，2015；Qiu et al.，2015；邓正华等，2018）。幼虫摄食不饱满时，主动游动并摄食，消化腺饱满后，会进行短时间休息，驻留在水底不游动，壳口闭合（Qiu et al.，2015；邓正华等，2018）。Qiu等（2015）研究认为，在测定牡蛎幼虫运动速度时，选择投喂后1～2 h进行测量，此时幼虫既非饥饿状态，也非饱食状态，便于观察。

贝类的耗氧率与其代谢活动相关，直接反映机体的生活和生理状况。因此，测定香港牡蛎的耗氧率，对其人工育苗及养殖具有重要的应用价值。目前有关香港牡蛎耗氧率的研究主要集中在成贝（廖文崇等，2011；林丽华等，2012），关于其幼虫的耗氧率尚未见报道。本研究发现，随着香港牡蛎幼虫的生长，其耗氧率逐渐增加，单个幼虫的耗氧率从0.67 ng/h增长到即将变态时的6.45 ng/h，表明在空气充氧的条件下，完全能够保证牡蛎幼虫对溶解氧的需求，溶解氧不构成幼虫培育的限制因素。以接近变态时期的幼虫（壳高300μm）耗氧量计算，集约化养殖密度为10～20个/mL时，溶解氧从5.5 mg/L降低至5.0 mg/L需要3～4 h。该结论为香港牡蛎人工育苗时设置停气自动预警阈值提供数据支持，也为突发断电断气事故援救提供时间参考。

对于双壳贝类幼虫的摄食行为，前人研究大多是针对养殖水体中饵料浓度或饵料种类（黎辉和金启增，1997；闫喜武等，2010；赵越等，2011；周银环等，2012），从个体角度开展贝类幼虫摄食行为的研究较少。以个体为单位，开展牡蛎幼虫的摄食行为研究，能够更加直观、深入地了解幼虫的摄食速率，将有助于人工育苗时饵料精准投喂，同时为贝类幼虫高密度培育设施设计提供参考（Qiu et al.，2015）。本研究发现，香港牡蛎幼虫的摄食速度呈现先增加后降低的趋势，在接近变态时，幼虫摄食率下降。这可能与幼虫的器官发育相关，幼虫在前期发育过程中，面盘以及外周纤毛不断发育完善，促使面盘滤水速度增加，从而增加了幼虫摄食速率（邓正华等，2018）。幼虫发育至后期接近变态时，器官结构发生改变，面盘和纤毛逐渐退化，逐步形成斧足和鳃，幼虫由浮游状态转变为匍匐于底部的爬行状态。因此，在面盘完全退化消失前幼虫摄食率和运动速率会降低（Qiu et al.，2015；邓正华等，2018）。本研究发现，香港牡蛎幼虫摄食率的变化范围为从D形幼虫时期的35 cells/h到接近变态前期的660 cells/h。该数据将有效应用于牡蛎的人工育苗，以刚孵化完成的D形幼虫为例，若培育密度为10个/mL，每8 h投喂一次，则每次投喂需保证培育池内金藻密度达2800 cells/mL。

光是一种直接或间接影响生物生长和代谢的能量信号。在生物进化的过程中，许多动物逐渐形成了对光的节律性变化的生物钟，这种节律性变化在很大程度上是由光敏器官的发生所介导（Naylor，2001；Gaston et al.，2017；Hobbs et al.，2021）。一般来说，浮游动物会在白天迁移到深海，以避免被捕食的威胁，并在夜间浮出水面进食（Hobbs et al.，2021）。因此，大多数浮游动物适应低光照环境，而不能忍受高强度的光。据报道，长牡蛎眼点幼虫可有效吸收波长为500～650 nm的光，特别是在色素区域（Kim et al.，2021）。水环境对可见光的折射产生了一个普遍的现象，即水生生物可感知并适应穿透性的较强的蓝光和绿光，对红光反应很少甚至没有反应（Fortunato et al.，2016），本研究得到相似的结果，香港牡蛎不同发育阶段的幼虫趋向于白光、蓝光和绿光，趋向红光的比例最低。Zhang等（2021a）对杂交牡蛎幼虫的研究中也发现，绿光和蓝光聚集的眼点幼虫和无眼点的幼虫数量最多，明显高于其他颜色的光，推测红色对眼点幼虫具有沉降诱导的作用。Kim等（2021）在对长牡蛎的研究中也提出用红光促进眼点幼虫沉降的方法。众所周知，自然海区及人工育苗中，牡蛎采苗效果不稳定，很大程度上取决于环境因素（钟方杰等，2014）。很多研究在试图提高牡蛎的采苗效果（方琦等，2001；祁剑飞等，2013；范瑞良等，2020）。本研究结果表明，红光具有诱导香港牡蛎幼虫沉降的作用，白光、蓝光和绿光则对幼虫有一定的吸引作用，这对牡蛎的幼虫培育和采苗具有重要的指导意义。