马氏珠母贝TLRP基因克隆及其功能研究

张美珍，王志新，吴羽媛，梁海鹰

（广东海洋大学水产学院，广东湛江 524088）

0 引言

【研究意义】Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一类重要的模式识别受体，在炎症发生、促免疫分子表达、免疫细胞成熟、配体识别、调节免疫应答及抗病毒感染等方面发挥重要作用（唐深和冷静，2004；唐沙等，2021）。TLRP（Toll-like receptor protein）属于TLRs家族成员之一，但其序列特征和功能尚未清楚。因此，克隆TLRP基因cDNA序列并进行表达特征分析，可为后续研究TLRP基因功能提供理论依据。【前人研究进展】TLRs家族种类较多，按细胞定位可分为细胞表面TLRs和细胞内TLRs。其中，细胞表面TLRs包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，主要识别脂多糖、脂蛋白等微生物膜 成 分；细 胞 内TLRs包 括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，主要识别细菌和病毒 的 核酸（Manavalan et al.，2011；Kawasaki and Kawai，2014）。除上述TLRs外，近年来在鱼类中还鉴定出特有的TLR27（Wang et al.，2015）。TLRs主要由三大部分组成，包括富含亮氨酸重复序列（Leucine rich repeats，LRRs）的胞外区、跨膜结构域（Transmembrane region，TM）及含有与白介素-1受体高度同源的TIR结构域（Toll/I L-1receptor domain）的胞内区（唐雪颖，2018），其中，LRRs的数量和序列特征决定了TLRs特异性识别病原的模式识别受体（Pattern-recognition receptors，PAMPs），TIR结构域可招募MyD88和TRIF等接头蛋白，激活下游信号通路，从而启动免疫反应（Narayanan and Park，2015；尹淑园，2020）。已有研究发现，鳗弧菌感染短蛸后，其肝脏中的TLR13基因表达量升高且在感染后24 h达最大值，暗示该基因参与鳗弧菌病变过程（周建波等，2019）；大弹涂鱼感染鳗弧菌后TLR5基因在其肝脏和脾脏中的表达量均呈先增加后减少的变化趋势，说明TLR5基因在细菌刺激下能产生一定的应激反应（刘坪等，2020）；细粒棘球蚴感染小鼠肝脏组织后，TLR2基因表达量增加且出现明显的炎症症状（王金龙，2020）。可见，TLRs在不同物种的免疫防御反应中扮演着重要角色。【本研究切入点】马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）是我国海水珍珠养殖的主要贝类之一，具有极高的经济价值。近年来，因海水水质日益恶化导致马氏珠母贝各种病害频繁发生，产珠能力及珍珠质量呈现下降趋势（何军军等，2019）；在马氏珠母贝植核过程中通常会带入大量病原体引起受体贝的强烈免疫应答，而导致吐核甚至死亡（Wang et al.，2017）。在细菌感染或植核后，马氏珠母贝部分免疫相关基因和蛋白会发生显著变化，其中TLRs发挥着重要作用（Wang et al.，2017，2019）。本课题组前期已完成马氏珠母贝基因组测序、组装和注释（Du et al.，2017），在基因组中发现多个TLRs基因，鉴定出TLR2（师尚丽等，2014）、TLR3（汪欢，2012）、TLR4（Wu et al.，2017）、TLR6（吴羽媛等，2017）和TLR13（吴羽媛等，2018），并进行初步分析，但仍有部分TLRs基因尚未得到鉴定。【拟解决的关键问题】通过RACE克隆马氏珠母贝TLRP基因（PmTLRP）cDNA序列，并运用实时荧光定量PCR检测PmTLRP在马氏珠母贝各组织中的表达情况和哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）刺激、植核及脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激后的表达模式，为进一步研究TLRs在马氏珠母贝中的免疫机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2龄马氏珠母贝取自广东省湛江市徐闻养殖场，在实验室海水中暂养7 d后挑选活性强、规格相近的马氏珠母贝进行后续试验。SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Clontech公司；rTaqDNA聚合酶、反转录试剂盒、pMD19-T载体及Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）等购自Ta-KaRa公司；纯化回收试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；SYBR®Select Master Mix和TRIzol购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 cDNA合成

采用TRIzol法提取马氏珠母贝肝胰腺等6个组织总RNA，以1.0%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop ND-1000紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度；然后参照RACE试剂盒说明制备3′-RACE和5′-RACE模板，同时按照RNase H说明合成cDNA模板。

1.3 PmTLRP基因cDNA序列克隆

从本课题组前期构建的马氏珠母贝珍珠囊转录组文库中筛选出注释为TLR的Unigenes序列，并设计特异性引物（表1）。运用巢式PCR扩增5′和3′末端，普通PCR扩增中间片段。扩增产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后回收目的基因进行纯化，连接至pMD19-T载体，再转化Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞，以LA固体培养基（含Amp+）进行过夜培养。挑取阳性单克隆菌落，接种至LB液体培养基中培养6 h后进行菌落PCR鉴定，将阳性质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司广州测序部测序。

1.4 生物信息学分析

测序结果和Unigenes序列采用DNAMAN进行比对分析，而拼接得到PmTLRP基因cDNA序列，以ORF Finder在线预测其氨基酸序列；采用ExPASy的ProtParam和ProtScale预测PmTLRP蛋白分子量、理论等电点（pI）及其亲/疏水性；利用SignalP 4.0和TMHMM v.2.0分别预测其信号肽及跨膜结构域；运用SMART、SoftBerry Psite和SOPMA预测PmTLRP蛋白的结构域、序列功能位点及其二级结构；经TLRs氨基酸多序列比对分析后，以MEGA X的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树。

1.5 PmTLRP基因组织表达分析

选取10只活性强、规格一致的马氏珠母贝，采集其血淋巴、外套膜、性腺、肝胰腺、闭壳肌和鳃组织，分别提取总RNA并反转录合成cDNA，以GAPDH基因为内参基因进行实时荧光定量PCR扩增。反应体系10.0μL：cDNA模板0.5μL，SYBR®Select Master Mix 5.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，灭菌ddH2O 3.7μL。扩增程序：95℃预变性5 min；95℃10 s，60℃15 s，72℃15 s，进行45个循环；添加1个熔解曲线（95℃10 s，60℃60 s，95℃1 s）；37℃延伸30 s。每个样品设3个重复，每个组织进行3次生物学重复。

1.6 哈维氏弧菌刺激及植核后PmTLRP基因在血淋巴中的表达情况

复苏保存的哈维氏弧菌菌株，取20 mL菌液加入至800 mL的TSB培养基中振荡培养至对数生长期，菌株以PBS洗涤3次后重悬于PBS。选取健康的马氏珠母贝140只，分成哈维氏弧菌刺激组和PBS对照组，每组70只。采用闭壳肌注射法向哈维氏弧菌刺激组马氏珠母贝注射哈维氏弧菌（1×107个/mL）进行诱导，100μL/只，对照组注射等量PBS。于注射刺激前（0 h）及刺激后2、6、8、12、16和24 h各处理组随机选取10只马氏珠母贝，抽取其血淋巴，4℃下3500 r/min离心5 min，收集血细胞，提取RNA并反转录合成cDNA。通过实时荧光定量PCR对Pm-TLRP基因进行定量分析，每个样品重复3次。同时，对暂养1周的80只马氏珠母进行植核试验，分别抽取植核前（0 h）及植核后5、10、15、20和30 d的血淋巴，4℃下3500 r/min离心5 min，收集血细胞，提取总RNA并反转录合成cDNA，以实时荧光定量PCR对PmTLRP基因进行定量分析。

1.7 LPS刺激后PmTLRP基因在血细胞和肝胰腺中的表达情况

选取200只健康的马氏珠母贝，分成LPS刺激组和PBS对照组，每组100只。采用从闭壳肌注射法向LPS刺激组马氏珠母贝注射10μg/mL的LPS，100 μL/只，对照组注射等量PBS。于注射刺激前（0 h）及刺激后2、3、4、6、8、12、16、24和48 h各处理组随机选取10只马氏珠母贝，分别抽取血淋巴和采集肝胰腺，提取总RNA并反转录合成cDNA后，以实时荧光定量PCR对PmTLRP基因进行定量分析。

1.8 统计分析

以GAPDH基因的表达量为校对基准，采用2-ΔΔCt法换算PmTLRP基因相对表达量，并以SPSS 19.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比较。

2 结果与分析

2.1 PmTLRP基因序列特征分析结果

测序结果和Unigenes序列经DNAMAN比对分析后拼接出PmTLRP基因cDNA序列全长为2214 bp，开放阅读框（ORF）共编码681个氨基酸残基（图1）；其5′非编码区（5′-UTR）为33 bp，3′非编码区（3′-UTR）为135 bp，且3′-UTR包含有27 bp的poly（A）尾巴和加尾信号序列AATAA。

2.2 PmTLRP蛋白理化性质分析结果

PmTLRP蛋白分子量为79.78 kD，理论等电点（pI）为5.66，不稳定系数为44.56，属于不稳定蛋白。ProtScale预测发现，在第383位氨基酸达最大亲水性，亲水性系数为-2.956；在第440～441位氨基酸达最大疏水性，亲水性系数为4.156；总平均亲水性系数为-0.313，故确定为亲水性蛋白（图2）。PmTLRP蛋白在第12～34位和第423～445位氨基酸处存在跨膜结构域，且在N-末端存在信号肽序列；TMHMM v.2.0预测结果（图3）表明，PmTLRP蛋白含有LRRs重复序列、跨膜结构域和TIR结构域。SoftBerry Psite功能位点预测发现，PmTLRP蛋白包含2个酪氨酸激酶磷酸化位点和CAAX box、3个cAMP和cGMP依赖性的蛋白激酶磷酸化位点与N-豆蔻酰化位点、7个N-糖基化位点、10个蛋白激酶C磷酸化位点、12个微体C-末端定位信号序列及13个酪蛋白激酶II磷酸化位点。SOPMA预测结果显示，PmTLRP蛋白二级结构中的α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲分别占39.21%、4.70%、19.68%和36.42%；采用SWISS-MODEL预测得知PmTLRP蛋白三维结构与美洲牡蛎（Crassostrea virginica）TLP蛋白相似（图4）。

2.3 多序列比对分析及系统发育进化树构建

运用DNAMAN对PmTLRP氨基酸序列与欧洲扇贝（Pecten maximus）Tollo氨基酸序列（XP_03375 4674.1）、虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）Tollo氨基酸序列（XP_021374025.1）、美洲牡蛎TLP氨基酸序列（XP_022322147.1）、福寿螺（Pomacea canaliculata）TLR2氨基酸序列（XP_025114565.1）和紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）TLR1氨基酸序列（DI511 60.1）进行多序列比对分析，结果（图5）显示，PmTLRP氨基酸序列与其他物种的TLRs氨基酸序列存在一定相似性，其中与美洲牡蛎TLP氨基酸序列的相似度较高，为48.75%。基于TLRs氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树（图6）也显示，马氏珠母贝与美洲牡蛎聚为一支，二者的亲缘关系较近。

2.4 PmTLRP基因组织表达特征分析结果

实时荧光定量PCR检测结果（图7）发现，Pm-TLRP基因在马氏珠母贝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鳃、性腺和闭壳肌中均有表达，以在外套膜、肝胰腺和血淋巴中的相对表达量较高，尤其是在肝胰腺中的相对表达量最高，显著高于在其他组织中的相对表达量（P＜0.05，下同）。

2.5 哈维氏弧菌刺激及植核后PmTLRP基因在血淋巴中的表达情况

运用实时荧光定量PCR检测PmTLRP基因在哈维氏弧菌刺激及植核后不同时期血淋巴中的表达情况，结果发现，在哈维氏弧菌刺激下，PmTLRP基因相对表达量在注射刺激后12 h开始上调，至注射刺激后16 h达最大值，约是注射刺激前（0 h）的19.0倍，其差异达极显著水平（P＜0.01），但在注射刺激后24 h逐渐恢复至原有水平（图8-A）。经植核刺激后，PmTLRP基因相对表达量在植核后5～20 d呈逐渐上升趋势（图8-B），但差异不显著（P＞0.05），于植核后30 d达最大值，约是植核前（0 h）的6.4倍，二者差异显著。

2.6 LPS刺激后PmTLRP基因在血淋巴和肝胰腺的表达情况

运用实时荧光定量PCR检测PmTLRP基因在LPS刺激后不同时期血淋巴和肝胰腺中的表达情况，结果发现，经LPS刺激后PmTLRP基因在马氏珠母血淋巴中的相对表达量先上升后下降，至注射刺激后3 h达最大值，约是对照组的5.0倍（图9-A），二者差异显著；PmTLRP基因在马氏珠母肝胰腺中的相对表达量呈升高→降低→升高→降低→升高的波动变化趋势（图9-B），至注射刺激后24 h相对表达量上调至最大值，约是对照组（0 h）的6.0倍。

3 讨论

TLRs是病原微生物感染入侵后识别免疫系统PAMPs的关键分子，也是识别细胞损伤或死亡所产生内源性损伤相关分子模式的重要分子，更是连接先天性免疫与适应性免疫的重要桥梁（Lu et al.，2016；尹淑园，2020）。本研究成功克隆获得PmTLRP基因cDNA序列并进行生物信息学分析，结果显示，PmTLRP基 因cDNA序 列 全 长 为2214 bp，共 编 码681个氨基酸残基；PmTLRP蛋白分子量为79.78 kD，pI为5.66，属于不稳定蛋白，含有信号肽、LRRs重复序列、跨膜结构域和TIR结构域，符合TLRs家族所具有的特征。PmTLRP氨基酸序列与其他物种的TLRs氨基酸序列存在一定相似性，其中与美洲牡蛎TLP氨基酸序列的相似度较高。

了解基因在不同组织器官中的表达模式是研究基因功能的基本手段之一（Cui et al.，2010）。本研究的实时荧光定量PCR检测结果显示，PmTLRP基因在马氏珠母贝肝胰腺、鳃和血淋巴中高表达，与其他物种的表达模式类似，如青蛤TLR4和TLR13基因在血细胞中的相对表达量最高（Ren et al.，2016），厚壳贻贝新型TLRs在肝胰腺中的相对表达量高于在鳃组织中的相对表达量（Xu et al.，2018），厚壳贻贝McTLR2基因在血细胞中的表达量最高且显著高于其他组织（Li et al.，2019）。在软体动物中，肝胰腺、鳃和血细胞均是极其重要的免疫器官，其中，肝胰腺参与代谢和消化吸收，鳃可过滤水中的细菌和有害物质及抵御细菌和毒性物质（王志新等，2013）。PmTLRP基因在肝胰腺中高表达暗示其可能参与马氏珠母贝免疫防御机制。

在贝类养殖过程中，微生物疾病危害可导致贝类死亡率增高，其中危害最严重的细菌性病原菌是弧菌（陈皓文，2005；方皓，2019；张颖雪等，2020）。哈维氏弧菌属于革兰氏阴性短杆菌，是多种海洋鱼类和无脊椎动物的病原体，主要通过包埋、侵袭宿主细胞，以及在宿主体内增殖和产生毒素等形式促使贝类发病（Zhang et al.，2020）。本研究采用实时荧光定量PCR检测哈维氏弧菌刺激后PmTLRP基因在马氏珠母贝血淋巴中的表达情况，结果发现Pm-TLRP基因相对表达量呈先上升后下降的变化趋势，与鮸鱼TLR5S基因（Huo et al.，2018）和海鲈TLR1基因（Li et al.，2018）经哈维氏弧菌刺激后在其肝脏中的表达趋势基本一致，表达量上升可能是机体识别哈维氏弧菌或哈维氏弧菌在宿主细胞内大量繁殖并产生毒素所致；但也有研究发现经哈维氏弧菌刺激后TLR6基因在马氏珠母贝血淋巴中的表达呈先上升后下降再上升趋势（吴羽媛等，2017）。可见，哈维氏弧菌能激活TLRs参与应答，但表达趋势存在差异。

LPS是在革兰氏阴性菌细胞壁中发现的一种具有代表性的分子（Park and Lee，2013），能激活NFκB信号通路，使机体分泌相关因子而介导免疫反应。本研究通过探究LPS刺激后PmTLRP基因在马氏珠母贝血淋巴和肝胰腺中的时序表达，结果发现PmTLRP基因在血淋巴中的相对表达量先上升后下降，而在肝胰腺中的相对表达量呈升高→降低→升高→降低→升高的波动变化趋势，第2次上升可能是由于机体所受感染程度增加而产生更多的TLRP来抵御病害。血淋巴是通过吞噬、伤口修复等方式参与细胞免疫，以及分泌非特异性体液分子参与体液免疫，因此PmTLRP基因在马氏珠母贝血淋巴中呈先上升后下降的表达变化趋势，与LPS刺激后TLR4基因在血淋巴中的表达趋势（Wu et al.，2017）一致，表明LPS刺激下不同组织中PmTLRP基因表达存在差异。本研究还发现，经LPS刺激和哈维氏弧菌刺激后PmTLRP基因在马氏珠母贝血淋巴中的表达趋势相同，但前者的相对表达量在刺激后2 h开始上升，而后者在刺激后12 h才开始上升且最大值出现在刺激后16 h，说明不同刺激下PmTLRP基因在同一组织中均产生免疫效应但作用时间存在明显差异。

植核是珍珠培育的关键步骤，是指向育珠贝内脏团中移植供体贝的细胞小片或珠核，通常会引起免疫排斥，严重时甚至导致育珠贝死亡（Wei et al.，2017），因此，检测植核后马氏珠母贝免疫相关基因在一段时间内的时序表达对开展移植免疫机制研究具有重要意义。本研究发现，PmTLRP基因相对表达量在植核后5 h即开始上升，可能与移植过程中切入外套膜组织造成的伤口有关（Adzigbli et al.，2020）。PmTLRP基因相对表达量在植核后5～30 d呈持续上升趋势，且在植核后30 d达最大值。Jiao等（2019）研究表明，同种异体植核和异种植核30 d后马氏珠母贝血淋巴中差异基因数量明显增多，且异种植核较同种异体植核损伤程度高。故推测本研究中植核后30 d的PmTLRP基因相对表达量达最大值是伤口感染程度增加所导致。吴羽媛等（2017）研究发现，TLR6基因在马氏珠母贝血淋巴中的表达最大值也是出现在植核后30 d，但TLR6基因表达量在植核后15 d才开始上升，说明植核能引起TLRs的免疫反应，但引起反应的时间有所差异。

4 结论

PmTLRP基因在马氏珠母贝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鳃、性腺和闭壳肌中均有表达，但表达水平存在差异，经哈维氏弧菌、植核及LPS刺激后呈明显上调表达趋势，说明TLRP在马氏珠母贝的免疫防御反应中扮演重要角色。