关岭牛FABP3和FABP4基因的分子特征及其组织表达分析

石鹏飞，阮涌，刘文娇，许家利，孙金魁，熊讯，许厚强

（贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点试验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点试验室，贵州贵阳 550025）

0 引言

【研究意义】脂肪酸结合蛋白（Fatty acid binding proteins，FABPs）是一类与脂肪酸高度亲和的小分子蛋白，其分子量为14～15 kD，由126～134个氨基酸残基组成，在脊椎和非脊椎动物的细胞质中广泛表达（Niewold et al.，2004；Wang et al.，2005；熊讯等，2022）。FABPs对脂肪酸的调控机制是通过与长链脂肪酸特异结合，从而将细胞膜上的脂肪酸转运至磷脂和甘油三酯的代谢位置（Di Pietro and Santome，2001；Ono and Odani，2010）。心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP，FABP3）与脂肪型脂肪酸结合蛋白（AFABP，FABP4）是FABPs家族的重要组成成员。因此，探究牛FABP3和FABP4基因的分子生物学特征及其组织表达特性，可为进一步揭示FABP3和FABP4对脂肪酸的调控机制提供理论依据。【前人研究进展】FABPs与过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）共同作用调控胞内脂肪酸的合成及分解，以维持体内葡萄糖和脂肪的平衡（Kusudo et al.，2015）。FABP3基因主要在心脏组织中表达，能与血浆长链脂肪酸结合，参与心肌及骨骼肌中脂肪酸的运输和利用（Zhang et al.，1999）。敲除FABP3基因的小鼠表现出心肌细胞无法有效利用血浆中的长链脂肪酸，从而影响心肌细胞功能（Binas et al.，1999）。此外，有研究表明FABP3基因对于小鼠棕色脂肪组织的耐寒性和脂肪酸的氧化不可或缺（Vergnes et al.，2011）。FABP4基因高表达于脂肪细胞中，是甘油三酯的贮存库，在甘油三酯的合成及分解过程中发挥重要作用（Prentice et al.，2019）；且FABP4分子中心具有与脂肪酸高度亲和的结合位点，能通过非共价键与长链脂肪酸结合而有利于脂肪酸溶解（Smith et al.，2007）。FABP4基因敲除小鼠的生理状态表现正常，但其血浆中的胆固醇和甘油三酯水平明显降低（Uysal et al.，2000）。在3T3细胞中，过表达FABP3基因具有促进前体脂肪细胞成脂的作用（Yi et al.，2014）；而过表达FABP4基因能增强线粒体功能，同时促进脂质沉积及脂肪细胞分化（谈笑，2014）。肌内脂肪（Intramuscular fat，IMF）是肉品质的重要指标之一，其含量直接影响肉质嫩度、适口性和风味（Hocquette et al.，2010）。Gerbens等（2000）研究表明猪FABP3基因遗传多态性与IMF含量呈正相关；Lim等（2015）研究证实牛FABP3基因表达水平在低IFM组和高IMF组间存在显著差异；Wang等（2015）研究发现FABP3和FABP4是影响肉质的重要基因，且FABP3基因表达水平与山羊IMF含量显著相关；Bartoň等（2016）研究发现过表达FABP4基因对牛肌内脂肪细胞的生成有显著影响；Yan等（2018）研究证实，绵羊FABP4基因在脂肪细胞分化过程中显著上调表达，且其基因多态性与IMF含量显著相关。【本研究切入点】目前，有关FABP3和FABP4基因在猪和羊上的研究较多报道，但针对牛FABP3和FABP4基因的具体分子结构、功能及相互作用尚未明确。【拟解决的关键问题】通过在线生物信息学分析软件分析关岭牛FABP3和FABP4基因的分子结构及其功能，并运用实时荧光定量PCR检测这2个基因在不同年龄段和不同组织中的表达差异，为揭示牛FABP3和FABP4基因对脂肪酸的调控作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物来自贵州省安顺市关岭县关岭牛产业园，随机选取相同饲养条件下的3日龄关岭犊牛、24月龄关岭牛（成年）及24月龄杂交牛（关岭牛×利木赞牛）各3头，采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、脂肪及小肠等组织样品，-80℃保存备用。主要试验试剂：TRIzol购自美国Gibco公司；DL2000 DNA Marker、2×TaqPCR StarMix、逆转录试剂盒（GenStar）购自西宝生物科技（上海）股份有限公司；荧光定量试剂Power UP SYBR GREEN Master Mix购自美国Thermo Fisher公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司，pMD19-T载体购自TaKaRa公司。主要仪器设备：电泳仪（DYY-2C）和水平电泳槽（DYCP-31C）购自北京六一仪器厂；超微量紫外分光光度计（NanoDrop 2000）购自美国Thermo Fisher公司；PCR仪（C1000 TouchTM）、荧光定量PCR仪（Biosens SC710）及凝胶成像系统（Universal HoodⅡ）购自美国Bio-rad公司。

1.2 引物设计与合成

根据NCBI已发布的牛FABP3基因序列（NM_174313.2）和FABP4基因序列（NM_174314.2），使用Primer Premier 5.0设计蛋白编码区（CDS）序列扩增引物及荧光定量分析特异性引物，筛选综合得分最高的引物序列，并委托擎科生物科技有限公司合成。

1.3 组织总RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol法分别提取犊牛、成年关岭牛与杂交牛各组织总RNA，使用超微量分光光度测定仪测定总RNA浓度及OD，质量合格的RNA置于-80℃冰箱保存。采用逆转录试剂盒合成cDNA第一链，-20℃保存备用。

1.4 FABP3和FABP4基因克隆

以cDNA为模板，PCR扩增牛FABP3和FABP4基因CDS序列。PCR反应体系10.0μL：cDNA模板0.4μL，正、反向引物（10μmol/L）各0.4μL，2×TaqPCR StarMix 5.0μL，ddH2O 3.8μL。扩增程序：94℃预变性2 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃60 s/kb，进行35个循环；72℃延伸10 min。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，胶回收扩增产物后连接至pMD19-T载体，然后在16℃下转化DH5α感受态细胞，加入液体培养基继续培养1.5 h，取样涂抹至固体培养基上，37℃过夜培养；经氨苄青霉素筛选后挑选单个菌落进行摇菌扩繁，菌液PCR鉴定呈阳性的质粒送至擎科生物科技有限公司测序。

1.5 FABP3和FABP4基因CDS序列生物信息学分析

使用ProtScale（https：//www.expasy.org/）和Prot-Param（https：//web.expasy.org/protscale/）分别分析FABP3、FABP4蛋白疏水性及其理化性质，采用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html%5D）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）分别预测2个蛋白的二、三级结构，运用TMHMM-2.0、SignalP-5.0及NetPhos-3.1分别预测分析FABP3、FABP4蛋白跨膜结构域、信号肽及磷酸化位点，利用STRING（https：//string-db.org/）预测FABP3和FABP4蛋白的相互作用蛋白，并以MegAlign和MEGA 7.0分别进行FABP3、FABP4氨基酸序列同源比对分析及构建系统发育进化树。

1.6 实时荧光定量PCR检测FABP3和FABP4基因表达

筛选出实时荧光定量PCR的特异性扩增引物，以GAPDH为内参基因，通过实时荧光定量PCR检测犊牛、成年关岭牛及杂交牛各组织中的FABP3和FABP4基因表达水平。实时荧光定量PCR反应体系：Power UP SYBR GREEN Master Mix 5.0μL，正、反向引物（10μmol/L）0.4μL，cDNA模板0.5μL，灭菌水3.7μL。扩增程序：95℃预变性2 min；95℃15 s，56℃15 s，72℃60 s，进行39个循环。每个样品设3个重复，通过2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

2 结果与分析

2.1 关岭牛FABP3和FABP4基因CDS序列扩增结果

以犊牛背最长肌cDNA为模板扩增FABP3和FABP4基因CDS序列，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示分别扩增出435 bp（图1-A）和433 bp（图1-B）的清晰条带，与预期结果相符，可进行下一步研究。

2.2 关岭牛FABP3和FABP4基因克隆及测序结果

经菌液PCR鉴定呈阳性的质粒送至擎科生物科技有限公司测序，测序结果与NCBI已发布的牛FABP3和FABP4基因序列进行比对分析，结果显示，关岭牛FABP3基因CDS序列第324位核苷酸（图2-A）存在碱基突变（G→A），为同义突变，氨基酸不发生改变；FABP4基因CDS序列第220和327位核苷酸（图2-B）存在碱基突变（A→G和A→G），致使甲硫氨酸和异亮氨酸突变为缬氨酸，第348和396位存在碱基同义突变（G→C和A→G），氨基酸不发生改变。

2.3 关岭牛FABP3和FABP4蛋白生物信息学分析结果

2.3.1 关岭牛FABP3和FABP4蛋白理化性质分析结果ProtParam预测结果显示，关岭牛FABP3基因CDS序列全长402 bp，共编码133个氨基酸残基，蛋白分子式为C654H1054N174O204S5，原子数为2091，分子量为14778.91 Da，理论等电点（pI）为6.73；含量最高的氨基酸为苏氨酸（占13.5%），含量最低的氨基酸是半胱氨酸和脯氨酸，各占0.8%；蛋白不稳定指数10.51，为稳定蛋白。FABP4基因CDS序列全长399 bp，共编码132个氨基酸残基，蛋白分子式为C645H1041N171O201S7，原子数为2065，分子量为14631.81 Da，pI为5.52；同样以缬氨酸含量最高（占12.9%），半胱氨酸、脯氨酸、色氨酸和酪氨酸的含量均较低，各占1.5%；蛋白不稳定指数12.68，为稳定蛋白。ProtScale预测结果显示，FABP3蛋白第114位亮氨酸疏水性最强（1.289）、第76位丙氨酸亲水性最强（-2.444），亲水性总体平均值为-0.247，属于亲水性蛋白（图3-A）；FABP4蛋白第46位天冬酰胺疏水性最强（1.789）、第76位脯氨酸亲水性最强（-2.278），亲水性总体平均值为-0.183，属于亲水性蛋白（图3-B）。

2.3.2 关岭牛FABP3和FABP4蛋白二、三级结构预结果通过SOMPA预测得知，FABP3蛋白二级结构由4种结构构成（图4-A），其中延伸链占36.09%、无规则卷曲占30.83%、α-螺旋占23.31%、β-转角占9.77%；FABP4蛋白同样由4种结构组成（图4-B），其中占比最高的也是延伸链（占37.12%），无规则卷曲占31.06%、α-螺旋占21.21%、β-转角占10.61%。通过SWISS-MODEL预测关岭牛FABP3和FABP4蛋白三级结构，结果（图5）发现二者的延伸链占比较高，同时富含α-螺旋结构，与蛋白二级结构预测结果相符。

2.3.3 关岭牛FABP3和FABP4蛋白跨膜结构域、信号肽及磷酸化位点预测结果通过TMHMM-2.0和SignalP-5.0分别预测关岭牛FABP3、FABP4蛋白跨膜结构域及信号肽，结果（图6和图7）显示二者均无跨膜结构域和信号肽。NetPhos-3.1预测显示，关岭牛FABP3蛋白存在26个磷酸化位点，包括6个丝氨酸磷酸化位点、18个苏氨酸磷酸化位点及2个酪氨酸磷酸化位点（图8-A）；关岭牛FABP4蛋白存在21个磷酸化位点，包括8个丝氨酸磷酸化位点、11个苏氨酸磷酸化位点及2个酪氨酸磷酸化位点（图8-B）。

2.3.4 关岭牛FABP3和FABP4蛋白的互作蛋白预测结果使用STRING对关岭牛FABP3、FABP4蛋白的互作蛋白进行预测，结果表明二者与FABP1、FABP6、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、脂蛋白脂肪酶（LPL）及激素敏感脂肪酶（LIPE）等存在互作关系（图9）。其中，FABP1和FABP6共属于FABPs家族成员，FABP1主要在肝脏内发挥作用，与细胞质中的游离脂肪酸及其辅酶A衍生物共同参与细胞内脂质转运；FABP6可结合胆汁酸并参与肠肝胆汁酸代谢，是脂肪酸代谢过程中的关键因子（Xu et al.，2019）。PPARγ调控脂肪酸的过氧化物酶体β-氧化途径，是脂肪细胞分化和葡萄糖稳态的关键调节因子（Janani and Ranjitha，2015）；在硬骨鱼类中，PPARγ参与FABPs的转录调控，并与FABPs家族蛋白协同调控细胞中的脂质代谢（Venkatachalam et al.，2017）。LIPE主要功能是将储存的甘油三酯水解为游离脂肪酸，还可将胆固醇酯转化为游离胆固醇以产生类固醇激素，对脂肪沉积至关重要（Goszczynski et al.，2014）。LPL则是甘油三酯降解的限速酶，参与各种脂蛋白代谢，是调控脂肪代谢的关键酶之一（王晶等，2013）。

2.4 FABP3和FABP4氨基酸序列同源比对分析结果

使用MegAlign对不同物种的FABP3和FABP4氨基酸序列进行同源比对分析，结果显示，关岭牛与牦牛、绵羊、马、人类、小鼠、大鼠、斑马鱼、猪、鸡的FABP3氨基酸序列相似性分别为100.0%、96.2%、91.0%、24.1%、85.7%、85.7%、69.9%、92.5%和78.2%，其中与人类的相似性最低（图10-A）；关岭牛与牦牛、绵羊、马、人类、小鼠、大鼠、斑马鱼、猪、鸡的FABP4氨基酸序列相似性分别为97.7%、93.2%、78.8%、84.1%、85.6%、83.3%、26.5%、81.8%和72.0%，其中与斑马鱼的相似性最低（图10-B）。基于FABP3和FABP4氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树（图11）均显示，关岭牛与牦牛的亲缘关系最近，其次是绵羊，与鸡和斑马鱼的亲缘关系较远。

2.5 FABP3和FABP4基因在犊牛、成年关岭牛及杂交牛不同组织中的表达规律

2.5.1 关岭牛FABP3和FABP4基因实时荧光定量PCR引物退火温度的确定根据引物合成报告，选择关岭牛FABP3和FABP4基因实时荧光定量PCR引物退火温度范围，结果显示扩增条带明亮单一（图12），最终确定关岭牛FABP3和FABP4基因实时荧光定量PCR扩增引物最佳退火温度分别为59和56℃。

2.5.2FABP3基因在犊牛、成年关岭牛和杂交牛不同组织中的表达情况FABP3基因在犊牛、成年关岭牛和杂交牛不同组织中均有表达，且以心脏的相对表达量最高（图13），具体表现：FABP3基因在犊牛中的相对表达量排序为心脏＞肾脏＞小肠＞脾脏＞背最长肌＞肝脏＞脂肪＞肺脏，在心脏、肾脏、小肠、脾脏和背最长肌间的相对表达量差异极显著（P＜0.01，下同），且均极显著高于其他组织中的相对表达量；FABP3基因在成年牛中的相对表达量排序为心脏＞脂肪＞脾脏＞小肠＞肺脏＞肾脏＞背最长肌＞肝脏，以心脏、脂肪和脾脏的相对表达量极显著高于其他组织；FABP3基因在杂交牛中的相对表达量排序为心脏＞脂肪＞脾脏＞肾脏＞小肠＞肝脏＞背最长肌＞肺脏，其中心脏和脂肪的相对表达量极显著高于其他组织。在不同年龄段关岭牛中，FABP3基因在成年牛心脏、脾脏、脂肪、肝脏和肺脏中的相对表达量极显著或显著（P＜0.05，下同）高于犊牛（图14-A）。此外，FABP3基因在成年牛心脏、肺脏和背最长肌中的相对表达量极显著高于杂交牛，而在肝脏和肾脏中的相对表达量极显著低于杂交牛（图14-B）。

2.5.3FABP4基因在犊牛、成年关岭牛和杂交牛不同组织中的表达情况FABP4基因在犊牛、成年牛和杂交牛的不同组织中均有表达，在脂肪中的相对表达量极显著高于其他组织，而在其他组织间的相对表达量差异均不显著（P＜0.05，下同）（图15）。在不同年龄阶段关岭牛中，FABP4基因在犊牛肾脏、背最长肌和脂肪中的相对表达量极显著高于成年牛，在心脏、肝脏、肺脏和小肠则表现为极显著或显著低于成年牛（图16-A）。此外，FABP4基因在成年牛心脏、肝脏和脾脏中的相对表达量均极显著低于杂交牛，但在脂肪中的相对表达量并无显著差异（图16-B）。

3 讨论

FABPs是细胞中重要的脂肪酸载体蛋白，对脂肪酸的储存、转运及代谢起重要调控作用（Furuhashi and Hotamisligil，2008）。FABP3在心肌和骨骼肌细胞中高度表达可引导脂肪酸进行β氧化，从而导致心肌细胞葡萄糖氧化增强及血浆脂肪酸水平升高（Smathers and Petersen，2011）。已有研究表明，过表达FABP3基因能触发丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化，启动与心肌梗死后心肌细胞凋亡及重塑相关的信号级联反应，进而导致缺血性心脏损伤（Zhuang et al.，2019）。FABP4基因主要表达于脂肪细胞和巨噬细胞，已广泛用作脂肪细胞成熟的标志（Furuhashi，2019）。此外，FABP4在能量循环中发挥着整合脂肪能量储存及运输的作用（Prentice et al.，2019）。近年来，有关FABP3和FABP4基因的研究主要与人类疾病及其免疫相关，在家畜上尤其是针对牛FABP3和FABP4基因的研究鲜见报道。

本研究成功克隆获得关岭牛FABP3和FABP4基因CDS序列，与NCBI已公布的对应序列对比分析发现，FABP3基因序列仅存在1个突变位点，且为同义突变不改变氨基酸序列，表明该基因在关岭牛上遗传较稳定；FABP4基因序列存在4个突变位点，有2个突变位点会引起氨基酸序列发生变化，而导致蛋白结构发生改变，其中无规则卷曲占比由23.48%提高到31.06%。无规则卷曲是蛋白肽链中与配体和受体结合的重要部分（赵采芹等，2022），FABP4蛋白中的无规则卷曲结构变化可能会影响其与脂肪酸的结合活性。FABP3和FABP4蛋白二、三级结构主要由延伸链和无规则卷曲构成，但这2种蛋白均无跨膜结构域和信号肽，故推测不是分泌蛋白。FABP3和FABP4氨基酸序列同源比对分析及构建系统发育进化树发现，关岭牛与牦牛、绵羊和猪的FABP3氨基酸序列相似性较高，除了与人类和斑马鱼的相似性较低外，与其他物种的相似性均在78.2%以上；关岭牛与牦牛、绵羊和小鼠的FABP4氨基酸序列相似性较高，除了与斑马鱼的相似性较低外，与其他物种的同源性均在72.0%以上。可见，关岭牛FABP3和FABP4基因具有较高的遗传保守性。

实时荧光定量PCR检测结果表明，FABP3和FABP4基因在关岭牛和杂交牛各组织中均有不同程度的表达，FABP3基因以在心脏中的相对表达量最高，与Li等（2016）、姚毅等（2017）、胡江等（2019）的研究结果相似。陈志辉等（2006）研究发现，FABP3基因在未成熟的动物肌肉组织中表达量较低或不表达，当细胞开始以脂肪酸作为能源物质时其表达量才不断提高。本研究也发现，FABP3基因在成年关岭牛多个组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏和脂肪）中的相对表达量显著或极显著高于关岭犊牛，但具体原理有待进一步探究。FABP3基因在成年关岭牛多个组织（心脏、脾脏、肺脏、背最长肌和小肠）中的相对表达量也显著或极显著高于杂交牛，表明FABP3基因对关岭牛的影响大于杂交牛。FABP4基因以关岭牛脂肪中的相对表达量极显著高于其他组织，与Soliman等（2007）、Li等（2015）、刘可可等（2022）的研究结果一致。FABP4基因在关岭犊牛脂肪中的表达量极显著高于成年关岭牛，与李文娟等（2006）、屠云洁等（2010）的研究结果恰好相反，可能是物种差异所致。此外，FABP3基因在成年关岭牛和杂交牛的脂肪中也有较高表达，故推测其与FABP4基因协同调控脂肪细胞中的脂肪酸代谢。综上所述，FABP3和FABP4基因在关岭牛和杂交牛各组织中均呈组织特异性表达，且与脂肪酸代谢密切相关。

4 结论

关岭牛FABP3和FABP4基因具有较高的遗传保守性，且以在心脏和脂肪中的表达水平较高，与脂肪酸代谢密切相关。