厚鳞柯叶水提物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌机理

2022-11-09罗泽萍潘立卫姚东梅

南方农业学报 2022年8期

罗泽萍，潘立卫，姚东梅

（河池学院化学与生物工程学院，广西河池 546300）

0 引言

【研究意义】奶牛乳房炎是一种主要由病原微生物感染乳腺组织引起的炎症反应，不仅影响奶牛产奶量而对奶牛养殖场造成直接的经济损失，还影响乳品质量，对人体健康和公共卫生安全造成极大威胁（陈云等，2021）。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引发奶牛乳房炎最普遍、最主要的病原菌之一（孟丹等，2017；赵艳坤等，2018），而长期使用抗生素治疗奶牛乳房炎极易产生致病性强、多重耐药的金黄色葡萄球菌，其中就包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）。MRSA是青霉素结合蛋白（Penicillin binding protein，PBP）改变且对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌，其耐药是由于获得编码PBP2a的mecA基因，而与金黄色葡萄球菌通常产生的PBP不同。PBP2a表现出异常低的β-内酰胺亲和力，且在正常致死的β-内酰胺浓度下仍具有活性，可进行细胞壁合成（陈云等，2019；李泽坤等，2021）。MRSA可引起不同类型的感染，除了与家畜相关的感染外，还会引起医院获得性和社区获得性的MRSA感染，如肺炎、蜂窝织炎、骨髓炎、心内膜炎及脑膜炎等（王俣棋等，2021）。因此，开展MRSA耐药机制研究及其药物筛选对科学防控奶牛乳房炎和保障公共卫生安全均具有重要意义。【前人研究进展】目前，MRSA感染的治疗方法主要采用抗生素疗法和抗生素替代疗法。抗生素治疗可选择万古霉素、替考拉宁、利奈咗烷、特拉万星和特地唑胺等（王宗朝等，2022）；抗生素替代疗法包括中药、微生态制剂（Jayashree et al.，2018）、溶菌酶（Li et al.，2019）、噬菌体（苏子龙等，2020）、疫苗免疫（Miller et al.，2020）、生物表面活性剂（Nataraj et al.，2021）、细菌素（Walsh et al.，2021）及抗菌肽（Atipairin et al.，2022）等。中药活性成分具有抗菌消炎、活血化瘀、调节免疫机能等功效，且毒副作用小，不易产生耐药性，在抗MRSA感染方面具有明显优势（杨健等，2016）。张铁焕等（2020）对19种中药乙醇提取物进行体外抗菌试验，结果发现地锦草、四块瓦、三颗针等14种中药对MRSA有显著的抗菌作用。此外，中药治疗MRSA感染与中医描述的热毒证十分吻合，已有研究证实鱼腥草注射液（黄庆红等，2017）、参附注射液（李劲松等，2017）、参麦注射液（贾晓佳，2019）及痰热清注射液（姜童童，2019）对MRSA感染的控制和治疗具有极大优越性。可见，中药在抗MRSA感染方面具有良好的开发应用前景。【本研究切入点】厚鳞柯（Lithocarpus pachylepisA.Camus）是壳斗科（Fagaceae）柯属（Lithocarpus）的一种植物，分布在我国云南和广西等地，其果实壁厚7～10 mm，种仁具有补肾壮阳的功效，民间多用于治疗肾虚疾病（陈先荣等，2017）。已知同科植物中的浙尖栲（Castanopsis acuminatissima）、没食子树（Quercus infectoria）、冬青栎（Q.ilex）、欧洲栗（Castanea sativa）、甜茶（L.celebicus）等均具有抑菌作用（周磊等，2012；田甜和文金华，2020），但关于厚鳞柯叶水提物（Aqueous extract ofLithocarpus pachylepisleaf，AELL）的药用价值研究鲜见报道，针对AELL抑菌作用机制的研究国内外尚无文献报道。【拟解决的关键问题】通过观察AELL对MRSA生物被膜、纤维蛋白原黏附率、呼吸代谢能力、菌体蛋白/DNA、细胞凋亡比例、活性氧（ROS）水平、细胞周期分布及菌体形态结构的影响，明确AELL的抑菌效果及其作用机制，以期为开发安全高效、低毒环保、无残留的抗MRSA药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药材及预处理将厚鳞柯叶切成碎块，称取25 kg分别用8倍和10倍的蒸馏水煎煮2 h，过滤，合并滤液，以95%乙醇沉淀并静置24 h，过滤，滤液浓缩成浸膏即获得AELL，5℃冰箱保存备用。

1.1.2 供试菌株MRSA菌株ATCC33591购自美国典型菌种保藏中心。

1.2.3 主要试剂与仪器设备LB肉汤培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；刃天青购自南京都莱生物技术有限公司；活性氧检测试剂盒、碘化丙啶（PI）和结晶紫染色液购自上海碧云天生物技术有限公司；SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒、预染彩色蛋白分子量Marker、核糖核酸酶A及SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自北京百普赛斯生物科技股份有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、碘硝基氯化四氮唑蓝（INT）、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液、Tris-HCl缓冲液、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；DNA检测试剂盒（二苯胺比色法）购自上海蓝季科技发展有限公司。仪器设备主要有：WD-9413A凝胶成像分析系统（北京六一生物科技有限公司）、BSA124S电子天平（德国赛多利斯公司）、BXM-100M全自动灭菌锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、C06超净工作台（广东达菲尔净化设备实业有限公司），LRH-1000F生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、DSF-60扫描电镜［迪赛福智能科技（广东）有限公司］、DL-7000C低速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）、TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、Accuri®C6Plus流式细胞仪（美国BD公司）和1550酶标仪（赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 AELL对MRSA生长的影响以刃天青为指示剂，采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），并以平板菌落计数法测定最小杀菌浓度（MBC）。通过比浊法测定AELL对MRSA生长的影响，具体操作：取MRSA悬液（OD600=0.1）加入AELL（0.16 mg/mL），以不添加AELL为空白对照组。置于37℃下振荡培养并分别测定不同时间段菌悬液的OD600。

1.2.2 AELL对MRSA生物被膜的影响采用结晶紫染色法和菌落计数法测定不同浓度AELL处理24和72 h对MRSA生物被膜的清除作用（Kang et al.，2018；王莉，2021）。

1.2.3 AELL对MRSA纤维蛋白原黏附率的影响取MRSA悬液（OD600=0.1）加入不同浓度的AELL，置于37℃下振荡培养至OD600=0.6时取出，5000 r/min离心10 min收集菌体，并以PBS重悬至OD600为1.0（严一舟等，2020）。向96孔板加入100μL浓度为20μg/mL的纤维蛋白原包被24 h，无菌PBS洗涤后加入5% BSA并封闭2 h，PBS洗涤再加入上述菌悬液，37℃下培育2 h；PBS洗涤，用25%甲醇固定30 min；PBS洗涤后加入结晶紫染料染色20 min；PBS洗涤，50℃下烘箱干燥，酶标仪测定OD570。相对黏附率（%）=（加药组OD570/对照组OD570）×100。

1.2.4 AELL对MRSA呼吸代谢的影响通过INT和TTC分别测定AELL处理后MASA的呼吸代谢活力及呼吸链脱氢酶活性（李远颂等，2022）。

1.2.5 AELL对MRSA细胞周期和细胞凋亡的影响取MRSA悬液（OD600=0.1）加入不同浓度的AELL，置于37℃下振荡培养。取连续培养6 h的各组菌悬液，5000 r/min离心10 min收集菌体，PBS洗涤后采用流式细胞仪测定各组MRSA的细胞周期分布和细胞凋亡情况。

1.2.6 AELL对MRSA胞内ROS水平的影响按照1.2.5的方法处理培养10 h，然后按活性氧检查试剂盒说明测定各组MRSA悬液的ROS水平。

1.2.7 AELL对MRSA蛋白含量的影响MRSA处理方法同1.2.5。取连续培养8 h的各组MRSA悬液，5000 r/min离心10 min收集菌体，加入4倍体积的无菌水，混匀，经100℃水浴煮沸10 min后5000 r/min离心10 min，收集的上清液即为可溶性蛋白。采用蛋白定量试剂盒测定各组MRSA的可溶性蛋白含量，并进行SDS-PAGE检测。

1.2.8 AELL对MRSA菌体DNA的影响MRSA处理方法同1.2.5。连续培养4 h后，取各组MRSA悬液10 mL，10000 r/min冷冻离心5 min收集菌体，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并以DNA检测试剂盒测定各组MRSA的DNA含量，同时用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测（康世墨，2020）。

1.2.9 AELL对MRSA形态结构的影响MRSA处理方法同1.2.1。取连续培育8 h的MRSA悬液，5000 r/min离心10 min收集菌体，PBS洗涤，经2.5%戊二醛溶液固定、乙醇梯度脱水、干燥、喷金等处理后，通过扫描电子显微镜观察菌体形态结构（张晶晶，2021）。

2 结果与分析

2.1 AELL对MRSA生长的影响

由图1可知，空白对照组MRSA繁殖非常快速，在培养12 h后进入对数生长期；而AELL处理组的MRSA未出现对数生长期，表明AELL可能通过影响MRSA对数生长期而发挥抑制或杀灭作用。AELL能有效抑制MRSA的生长，其MIC和MBC均为0.15625 mg/mL。

2.2 AELL对MRSA生物被膜及纤维蛋白原黏附率的影响

由表1可见，随着AELL处理浓度的增加，MRSA培养24和72 h的生物被膜含量逐渐下降，表明AELL对MRSA早期和成熟期形成的生物被膜均有一定清除作用。随着AELL处理浓度的增加，MRSA相对黏附率也呈逐渐下降趋势，从47.486%下降至5.440%，即AELL能减弱MASA对纤维蛋白原的黏附作用。

表1 AELL对MRSA生物被膜及纤维蛋白原黏附率的影响（n=3）Table 1 Effects of AELL on adhesion rate of MRSA biofilm and fibrinogen（n=3）

2.3 AELL对MRSA呼吸代谢的影响

由表2可知，AELL处理组MRSA的呼吸代谢活力随着培养时间的延长而逐渐降低，空白对照组MRSA的呼吸代谢活力变化不明显，表明经AELL处理后MRSA的呼吸代谢活力受抑制。空白对照组MRSA的呼吸链脱氢酶活性也随培养时间的延长逐渐增强，而AELL处理组MRSA的呼吸链脱氢酶活性明显低于空白对照组，说明AELL可能是通过抑制MRSA呼吸链脱氢酶活性促使菌株处于死亡甚至呈破碎状态。

2.4 AELL对MRSA细胞周期的影响

在细菌增殖周期中，S期对细菌合成DNA、细胞增殖和细胞分裂至关重要。由图2可看出，与空白对照组相比，0.16 mg/mL组处于S期的MRSA增加9.00%，0.32 mg/mL组处于S期的MRSA增加15.86%，0.64 mg/mL组处于S期的MRSA增加23.93%。可见，经AELL处理后MRSA的生长周期阻滞在S期，推测AELL是通过扰乱MRSA的细胞周期而实现抑菌作用。

2.5 AELL对MRSA细胞凋亡的影响

以磷脂酰丝氨酸的特异性探针Annexin V探究AELL对MRSA细胞凋亡的影响，凋亡率（%）=Q2+Q3。由图3可见，与空白对照组相比，经AELL处理后MRSA的细胞凋亡率明显增加，0.16 mg/mL组、0.32 mg/mL组及0.64 mg/mL组的MRSA细胞凋亡率依次增加3.45%、9.96%和14.09%，说明AELL可能具有打破MRSA内环境稳定，促进菌体凋亡的作用。

2.6 AELL对MRSA胞内ROS水平的影响

由图4可知，与空白对照组相比，0.16 mg/mL组、0.32 mg/mL组和0.64 mg/mL组的MRSA胞内ROS含量依次增加4.12%、10.16%和23.66%，表明AELL能促进MRSA胞内脂质过氧化，从而破坏菌体脂质导致死亡。

2.7 AELL对MRSA蛋白及DNA的影响

由图5可看出，MRSA可溶性蛋白含量随AELL浓度的增加而逐渐降低，与空白对照组相比，0.16 mg/mL组、0.32 mg/mL组和0.64 mg/mL组的MRSA可溶性蛋白含量分别下降24.13%、51.12%和74.72%；SDS-PAGE检测结果（图6）也显示，经AELL处理后MRSA蛋白条带颜色有不同程度变浅，甚至出现条带丢失现象。说明AELL可能是通过破坏菌株蛋白或抑制其合成而对MRSA产生影响。此外，随着AELL处理浓度的增加，MRSA胞内DNA含量依次减少（图7），与空白对照组相比，0.16 mg/mL组、0.32 mg/mL组和0.64 mg/mL组的DNA含量分别下降29.07%、43.33%和76.23%。由图8可看出，经AELL处理后MRSA的DNA条带逐渐变暗，且迁移率逐渐降低，故推测AELL是通过与DNA结合而破坏菌体DNA功能，进而达到抑制MRSA生长的效果。

2.8 AELL对MRSA形态结构的影响

在扫描电镜下可清楚观察到空白对照组MRSA的形态结构特征，其外观完整规则，表面平整圆滑；经AELL处理后，MRSA的形态结构不规则、萎缩、畸形，细胞塌陷，细胞间隙出现裂痕，细胞壁严重弯曲、变形（图9）。

3 讨论

我国蕴藏着极为丰富的传统中药资源，其具有价格低廉、取材天然及毒副作用小等优点，更重要的是不易产生耐药性。中药在抗感染性疾病中已占据重要位置，其抑菌机理主要是通过破坏细菌生物被膜、降低细菌对宿主细胞黏附力、抑制细菌蛋白和遗传物质合成、影响细菌呼吸代谢、促进ROS积累及破坏细胞结构等多方面作用，而抑制细菌生长或杀灭细菌（李贞等，2019）。为此，本研究通过观察AELL对MRSA生物被膜、纤维蛋白原黏附力、呼吸代谢能力、菌体蛋白/DNA、细胞凋亡比例、胞内ROS水平、细胞周期分布及菌体形态结构的影响，旨在明确AELL对MRSA的抑菌效果及其作用机制，为动物抗病原菌感染和新型抗生素开发提供理论依据

当细菌数量足够多就会建立生物被膜的保护性群落，使得抗生素难以侵入而杀灭细菌，是病原菌引起慢性持续性感染及感染难以治愈的主要原因。MRSA可吸附在医用器材或宿主组织而产生形成生物被膜，待生物被膜发展成熟后其致病性和传染性迅速增强（张鹏飞等，2020）。生物被膜有利于细菌逃脱或对抗宿主的防御机制、降低抗生素杀伤力、提高细菌对低氧或低营养的耐受力，也是MRSA感染变得越来越难以治疗的重要原因（Liu et al.，2018；常佳伟等，2019）。耐药金黄色葡萄球菌生物被膜的形成是奶牛乳腺炎反复感染、治疗困难的关键问题，但有研究表明许多中药及其活性成分能通过抑制生物被膜的形成或破坏已形成的生物被膜而起到杀菌作用。吕婷婷等（2022）研究发现大黄酸具有破坏木糖葡萄球菌早期和成熟生物被膜的作用，本研究也发现AELL对MRSA培养24或72 h形成的生物被膜均有一定的清除作用。此外，当致病性MRSA趋向宿主并附着于宿主细胞时，会产生表面蛋白和分泌蛋白，且不同的蛋白可特异性结合于宿主纤维蛋白原，包括聚集因子A和聚集因子B，从而促使细菌克隆生长并建立感染中心点。MRSA结合宿主纤维蛋白原是其致病性的必备条件，抑制MRSA对纤维蛋白原的黏附作用，即可有效降低其致病性（尚伟龙，2019；邹治情，2020；Chung et al.，2021）。吴富鑫（2021）研究发现，苦参碱浓度为6 mg/mL时临床分离型菌株对乳腺上皮细胞的黏附率降低至14.6%；本研究也发现经AELL处理后MRSA的纤维蛋白原黏附率从47.486%下降至5.440%。

细胞氧化还原平衡易受环境影响，逆环境条件下ROS快速增加将对细胞的蛋白、脂质及DNA产生一定损伤，最终导致细胞死亡（赵凝秋等，2021）。本研究结果表明，经AELL处理后MRSA胞内ROS含量由0.24%增加到23.90%；翁甜等（2022）也研究发现，香叶醇通过促进柑橘酸腐菌脂质过氧化和ROS积累而影响其正常生理功能。蛋白作为生物体内最重要的生物大分子，是生命活动的最主要载体，更是生物功能的执行者。每种细胞的生理活性均离不开不同结构和功能的蛋白，蛋白的合成则离不开遗传物质。当遗传物质的合成或表达受到影响，细胞基因转录激活、蛋白翻译、细胞周期调控、信号转导等重要生命过程均会受到影响，因此，通过检测细菌胞内各时期蛋白和DNA的含量及细胞周期分布情况可作为抑菌效果判断的重要依据。路振康等（2022）通过SDS-PAGE检测发现核桃青皮提取物可抑制大肠杆菌蛋白表达。本研究也发现，经AELL处理后MRSA可溶性蛋白呈明显的下降趋势，AELL还能扰乱MRSA的细胞周期分布，使其停滞在S期，同时抑制MRSA核酸合成。

呼吸作用是细菌代谢的重要组成部分，脂类和糖类在体内氧化释放出的能量可用于核酸、蛋白等生物合成；一旦呼吸作用失调，供给生命活动的能量无法正常供给，生物体的功能及新陈代谢发生紊乱，甚至趋于死亡（周凯仁等，2021）。细菌耗氧量和某些代谢酶活性也可作为抑菌效果的判断标准。线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，活细胞在线粒体脱氢酶作用下会生成氢离子，INT结合氢离子后生成紫红色的INT甲臜，即INT甲臜生成数量是界定细胞呼吸代谢活力的一项重要指标。本研究结果表明，经AELL处理后MRSA呼吸代谢活力逐渐降低，呼吸代谢活动受抑制。呼吸链的作用是将电子从供体传递给受体，生成细胞新陈代谢所需的能量。TTC进入细菌胞体后，与呼吸链脱氢酶结合在一起，催化生成的1,3,5-三苯甲臜（TF）可用于表征细菌呼吸链脱氢酶的活性情况。吴金勇（2020）研究证实，经牛至和鱼腥草复配精油处理可显著抑制肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏杆菌等5种病原菌的呼吸作用。本研究也发现，AELL能抑制MRSA呼吸链脱氢酶活性，故推测AELL是通过抑制MRSA呼吸链脱氢酶活性而促使菌株处于死亡甚至呈破碎状态。

细菌的细胞壁和细胞膜具有保持菌体内各种物质含量稳定及维持细胞正常生命活动的作用，其结构与功能遭到破坏时会造成胞内重要物质外漏，继而导致菌体死亡。扫描电镜可直观观察到细菌细胞壁或细胞膜的受损情况，是研究药物对细菌细胞膜和细胞壁破坏作用的常用方法。刘增援（2021）通过扫描电镜观察发现，小叶地锦处理多重耐药大肠杆菌后其菌株形态表现出肿胀、内凹、皱缩等特征。本研究通过扫描电镜观察发现，经AELL处理后MRSA的形态结构出现不规则、萎缩、畸形，细胞塌陷，细胞壁严重弯曲、变形等现象。可见，AELL具有开发成抗MRSA兽药或植物杀菌剂的潜力。抑菌活性成分研究是开发新型高效、低毒兽药或农药的重要环节，因此AELL抑菌单体化合物的提取分离有待进一步探究。