夜间增温下施硅对稻田CH4好氧氧化及其氮响应的影响

2022-11-09周聪谢晴薛梦琪张耀鸿娄运生贾仲君高霄鹏

南方农业学报 2022年8期

周聪，谢晴，2，薛梦琪，，张耀鸿*，娄运生，贾仲君，高霄鹏

（1南京信息工程大学气象灾害预报预警与评估协同创新中心/江苏省农业气象重点实验室，江苏南京 210044；2气象防灾减灾湖南省重点实验室，湖南长沙 410118；3中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室，江苏南京 210008；4曼尼托巴大学，加拿大温尼伯R3T2N2）

0引言

【研究意义】稻田是陆地甲烷（CH4）排放的重要源。据估算，稻田CH4排放约占全球CH4总排放量的17%（Schimel，2000）。稻田土壤中产生的CH4气体在进入大气之前大部分被氧化去除，是CH4消减的最主要过程（Cai and Mosier，2000）。其中，以好氧CH4氧化作用最重要，对稳定大气CH4含量及减缓全球温室效应具有重要意义。联合国政府间气候变化专门委员会第五次报告显示，近半个世纪全球平均地表温度持续变暖，近地气温增幅呈明显的昼夜不对称性，即夜间增幅显著高于白天（IPCC，2014）。夜间增温对稻田CH4氧化的影响受到人们普遍关注（刘燕等，2020；郭家宏等，2022）。硅是植物的有益元素之一，且是水稻的必需营养元素。叶片的硅化细胞对于散射光的透过量为绿色细胞的10倍，可使其吸收更多的光源，促进光合作用；还可促进碳水化合物的长距离转运，协调植物的库—源关系（高臣等，2011）。因此，研究硅肥对稻田CH4氧化过程及其温度敏感性的影响，对于缓解陆地生态系统典型湿地CH4排放及探索有效的减排措施具有重要意义。【前人研究进展】CH4排放通量是CH4产生过程和氧化过程的净综合结果。一般认为，增温强烈影响水稻的光合速率、光合碳分配、根系分泌及输导组织泌氧等生理过程，对根际土壤微环境（营养水平、酸碱度、氧化还原电位等）产生重要影响，进而对微生物驱动的CH4产生和氧化过程有显著影响效应（Voigt et al.，2017；Zhang et al.，2017；Li et al.，2020；Liu et al.，2020）。Zhou等（2018）研究认为，陆地湿地系统CH4排放量的土壤温度敏感系数（Q10值）介于1.7～28.0，强烈受CH4氧化作用贡献的影响。Wang等（2022）在双季稻田中进行田间开放式增温后发现，增温提高了水稻有效分蘖数和根系生物量，有利于O2从叶片运输到根际中，促进根际土壤的CH4氧化速率，而对CH4氧化菌功能基因pmoA的丰度无明显影响。Yan等（2022）研究发现，增温导致全球湿地系统CH4排放通量增加10.1%，而CH4氧化过程对此增幅的贡献尚不清楚。此外，钢渣硅肥具有提高水稻产量、提升土壤肥力的特性，在日本和韩国等地区已普遍施用（Das et al.，2019）。Lim等（2022）发现，施硅降低了水稻生长季CH4排放量的15%，其原因是钢渣硅肥提高了水稻根际的氧化还原电位，有利于CH4好氧氧化作用的进行；同时钢渣硅肥中含有丰富的Fe3+和Mn4+，可作为电子供体促进CH4厌氧氧化过程（Ali et al.，2008；Wang et al.，2015）。相反，有报道发现，钢渣硅肥促进了泥炭湿地CH4排放，原因是钢渣硅肥中释放出的P、Ca、Mg等元素促进了CH4产生菌的活性（Reithmaier et al.，2017；Hömberg et al.，2021）。Nakamura等（2022）研究发现，施硅对森林湿地土壤的CH4排放通量和产生过程均无影响，暗示施硅对CH4氧化过程也无明显影响。【本研究切入点】目前，有关增温或施硅单因子对稻田土壤CH4排放通量的影响已有报道，但二者耦合对稻田土壤CH4消减过程的影响尚不清楚；且以往的报道大多基于培养箱或玻璃温室进行增温，不能代表大田夜间增温的真实情况。因此，有必要研究增温/施硅对稻田CH4氧化过程的影响效应，阐明施硅条件下增温稻田CH4好氧氧化驱动的固碳特征变化规律。【拟解决的关键问题】采用田间开放式夜间增温系统提供长期增温环境，运用13CH4稳定性同位素标记法研究夜间增温/施硅对稻田土壤CH4好氧氧化过程及其有机碳累积的影响，为探索稻田温室气体减排措施提供科学依据和实践途径。

1 材料与方法

1.1 供试材料

田间试验在南京信息工程大学农业气象试验站进行。试验点属于亚热带湿润气候区，年均降水量1100 mm，年均气温15.6℃。土壤为潴育型水稻土，灰马肝土属，质地为壤质粘土。农作方式为当地典型的稻麦轮作制。供试氮、磷、钾肥料为当地普遍施用的高浓度复合肥（15-15-15）。供试硅肥为钢渣硅肥，取自南京钢铁集团有限公司，该粉状矿渣型硅肥有效硅（SiO2）含量为13.8%。

1.2 试验方法

试验站自2016年6月采用田间开放式增温系统设置长期试验一直持续至今。增温设2个水平，即夜间常温和夜间增温；施硅设2个水平，即不施硅和施硅（SiO2）200 kg/ha。试验共设4个处理，即夜间常温不施硅（CK）、夜间增温不施硅（NW）、夜间增温施硅（NW+Si）及夜间常温施硅（Si）。采用随机区组试验设计，每处理3次重复。小区面积4 m2（2 m×2 m）。在每处理区内采用根袋法，将根际土与非根际土用300目尼龙袋隔开。夜间增温采用被动式增温方式进行，即在试验小区四周搭设不锈钢管支架，将铝箔反光膜架设于支架上，在农作物（水稻/小麦）生长期内，夜间（19：00—6：00，随日长有所增减）用反光膜覆盖农作物冠层，白天将铝箔反光膜卷起。随农作物生长发育进程，及时调整支架高度，使反光膜与农作物冠层保持在0.3 m左右。为保持各试验小区植物受光度的一致性，在常温对照区内也搭设不锈钢管支架，而无反光膜覆盖。采用温度记录仪自动记录作物冠层和土壤5 cm处全生育期温度，数据记录间隔为30 min。前期试验结果表明，与常温对照区相比，水稻冠层和5 cm土层的全生育期平均夜温分别提高1.21和0.62℃，增温效果明显（郑泽华等，2017）。

2020年9月，分别从各处理稻田中采集0～10 cm耕层的根际土与非根际土。一部分鲜土用于测定各试验处理区耕层土壤的基本理化性质；另一部分鲜土用于培养试验，测定稻田土壤的CH4好氧氧化速率。其中，土壤有机碳（SOC）采用H2SO4消煮—FeSO4滴定法测定，可溶性有机碳（TOC）采用TOC分析仪测定，土壤总氮采用凯氏定氮法测定，铵氮（NH4+）和硝氮（NO3-）采用KCl提取—流动分析仪测定，土壤有效磷采用钼蓝比色法测定，土壤速效钾采用火焰光度计测定（Gao et al.，2022）。

1.3 土壤CH4氧化速率及13C有机碳分析

称取2.000 g鲜土放入12 mL的Labco顶空瓶，加入2 mL去离子水后盖好盖子，充分摇晃30 s成均匀泥浆，25℃预培养1 d。然后培养瓶中抽真空—充氩气3次，再置换等量的4 mL高纯O2和1 mL13CH4后进行正式培养（胡敏杰等，2017）。每个瓶子的顶空空间在培养开始时含有约10%的CH4浓度，25℃避光培养。同时，进行3种不同形态氮添加处理，分别为：NH4+-N、NO3--N和尿素（Urea），使瓶中最终N浓度为5 mmol/L。每个稻田土壤样品共计4个培养添加处理，每处理3次重复。采用气相色谱仪（Agilent 7890B）测定0时刻CH4和CO2起始浓度。之后分别在第3、6、9和12 d采气测定培养瓶顶空气体的CH4和CO2浓度。根据CH4浓度随时间的变化计算CH4氧化速率（R）。

式中，C0为零时刻顶空气体中的CH4浓度（μL/L），Ct为培养t时刻后的CH4浓度（μL/L），V为培养瓶体积（L），ρ为标准状态下CH4密度（g/L），t为培养时间（d），m为土壤干土质量（g）。

培养结束后，瓶内加入2 mol/L的HCl溶液进行土壤酸化处理（去除无机碳），然后将土壤泥浆冷冻干燥后测定有机碳含量及其13C有机碳（13C-SOC）丰度值和净增量。

1.4 统计分析

试验数据采用Excel 2016和SPSS 21.0进行整理分析，并对处理间土壤理化性质、CH4氧化速率及其固碳量进行方差分析和多重比较，对CH4氧化速率与土壤理化性质进行相关分析。利用Origin 2021制图。

2 结果与分析

2.1 长期试验处理下稻田土壤的理化性质变化

经过4年多的长期增温/施硅处理后，各试验小区耕层土壤的理化性质发生明显变化。由表1可知，Si处理的稻田耕层土壤有机碳和可溶性有机碳含量分别较CK显著提高10.5%和26.7%（P＜0.05，下同）；而NW处理的这2个指标则分别较CK显著降低11.9%和9.9%。NW+Si处理的稻田可溶性有机碳含量较CK显著提高16.4%，而有机碳和总氮含量均显著低于CK；Si处理的土壤总氮、氨氮、硝氮含量均显著高于其他处理，而NW处理的氮含量均为最低。施加硅肥处理（Si和NW+Si）的有效磷和速效钾含量普遍高于未施硅肥处理（CK和NW），且Si处理的土壤有效磷和速效钾含量显著高于NW处理。以上结果表明，施加硅肥有利于提升耕层土壤的有机碳、活性碳及磷和钾含量。

表1 长期试验处理下稻田土壤的理化性质Table 1 Soil physicochemical properties of paddy fields under long-term experimental treatments

2.2 不同处理的稻田土壤CH4好氧氧化速率

由培养期间起始和终止时刻顶空气体CH4浓度变化可计算得到土壤CH4好氧氧化速率。由图1可知，稻田非根际土的CH4好氧氧化速率明显高于根际土，且4个处理间无显著差异（P＞0.05，下同），其数值介于16.0～17.0μg/（g·d）。对于根际土而言，4个处理的稻田CH4好氧氧化速率存在显著差异，施硅处理（Si和NW+Si）的氧化速率显著高于未施硅处理（CK和NW），其中Si处理的土壤CH4好氧氧化速率最高，为10.9μg/（g·d），而NW处理则最低，为7.5μg/（g·d）。

将根际土和非根际土的CH4氧化速率分别与土壤（包括根际土和非根际土）理化性质进行相关分析，发现根际土CH4氧化速率与土壤有机碳和总氮含量呈显著正相关，相关系数分别为0.71和0.74；与水溶性有机碳、矿质态氮、有效磷和速效钾含量均呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数在0.83～0.89。表明增温/施硅处理后，土壤理化性质的变化可能是稻田根际土壤CH4氧化速率产生差异的重要原因。相反，非根际土CH4氧化速率与土壤理化性质之间未表现出显著相关性。

2.3 不同处理土壤的13C-SOC丰度值与净增量

测定CH4氧化速率的培养试验结束后，将培养瓶内的泥浆酸化处理后冷冻干燥，分析其有机碳含量及13C丰度值，进而计算由底物13CH4被氧化并同化进入到土壤中的13C-SOC净增量。由图2可知，所有供试土壤的13C-SOC丰度值均远高于其自然丰度值（1.08%），表明培养瓶内进行了明显的13CH4好氧氧化过程，且有相当一部分底物13CH4被同化进入了土壤中。其中，在非根际土中，施硅处理（Si和NW+Si）的13C-SOC丰度值显著高于未施硅处理（CK和NW），Si稻田土壤13C-SOC丰度值最高，达3.45%，而NW处理则最低，为3.28%。根际土也表现出与非根际土类似的变化规律，且其13C-SOC丰度值总体均明显低于非根际土。

由图2还可看出，在底物13CH4好氧氧化过程中，有一部分13CH4被同化到土壤有机碳中。对于根际土而言，Si处理的土壤13C-SOC净增量为13.6μmol/g，显著高于其他处理。对于非根际土而言，施硅处理（Si和NW+Si）的13C-SOC净增量显著高于未施硅处理（CK和NW），其中NW+Si处理最高，达13.2μmol/g，而CK最低。总体而言，根际土的13C-SOC净增量小于非根际土（Si稻田除外）。

将土壤的13C-SOC净增量与13CH4净消耗量相比，可反映出稻田土壤CH4好氧氧化过程的固碳效率。本研究中发现，施硅处理（Si和NW+Si）的CH4好氧氧化固碳效率为61%～66%，明显高于CK和NW处理的固碳效率（51%～54%），表明施硅有利于CH4好氧氧化过程中有较多的CH4碳源被固定到土壤中，促进土壤有机碳的累积。

2.4 增温/施硅稻田CH4氧化速率对氮输入的响应特征

在测定CH4氧化速率的培养试验中，分别添加NH4+-N、NO3--N和Urea进行培养，以模拟增温/施硅稻田在田间施加化学氮肥情景下CH4氧化过程的变化特征。由图3可知，在添加3种氮形态条件下，4个处理非根际土中的CH4氧化速率均明显高于根际土（NO3--N的Si处理除外），这与无氮添加下的氧化速率特征一致，表明施加氮肥对根际土与非根际土之间的CH4氧化速率差异无明显影响作用。对于非根际土而言，添加NH4+-N、NO3--N或Urea条件下，4个处理的CH4氧化速率差异明显，且均以NW+Si处理的氧化速率最高，达33.6～36.8μg/（g·d）。相对于无氮添加处理，添加NH4+-N和Urea均明显提高了4个处理土壤的CH4氧化速率，且以添加NH4+-N效果更明显。对于根际土而言，添加NH4+-N条件下，CK的CH4氧化速率显著高于NW和Si处理，而NW+Si处理则最低。添加NO3--N条件下，Si处理的CH4氧化速率显著高于其他处理，与无氮添加条件下的速率特征一致。添加Urea条件下，NW+Si处理的CH4氧化速率为18.2 μg/（g·d），显著高于其他处理，而NW稻田则最低。

综合来看，与无氮添加相比，添加氮条件下4个处理的根际土和非根际土CH4氧化速率总体有大幅提升，说明施加氮肥对增温/施硅稻田的CH4好氧氧化具有促进作用。在3种氮添加条件下，NW+Si处理非根际土的CH4氧化速率均显著高于其他处理，且相对无氮添加处理其增幅也最大，说明NW+Si处理非根际土CH4好氧氧化对外源氮输入的响应度最高。

2.5 CH4氧化过程驱动的13C-SOC净增量对氮输入的响应

由图4可知，在添加3种氮形态条件下，4个处理非根际土中的13C-SOC净增量均明显高于根际土（Si处理除外），与无氮添加下的净增量特征一致，表明施加氮肥对根际土与非根际土的13C-SOC净增量差异无明显影响。对于根际土而言，在添加3种形态氮条件下，Si处理土壤CH4氧化过程驱动的13C-SOC净增量显著高于其他处理，与无氮添加处理的变化特征一致。对于非根际土而言，施硅处理（Si和NW+Si）的13C-SOC净增量显著高于未施硅处理（CK和NW），其中NW+Si处理最高，达13.3μmol/g，与不添加氮条件下的净增量基本持平。总体而言，与不添加氮处理相比，添加3种氮条件下4个处理的土壤CH4氧化过程介导的13C-SOC净增量绝对值变化幅度很小，说明施加氮肥对增温/施硅稻田CH4氧化驱动的土壤固碳量无明显影响。此外，添加3种氮条件下，施硅处理（Si和NW+Si）的CH4好氧氧化固碳效率（48%～55%）明显高于CK和NW处理的固碳效率（38%～51%），与无氮添加下固碳效率的规律一致，但施加氮肥降低了增温/施硅稻田土壤CH4氧化驱动的固碳效率。

3 讨论

CH4好氧氧化作用是稻田土壤CH4消减的主要过程，其由好氧甲烷氧化菌在有O2参与条件下催化完成，该微生物以CH4为唯一碳源和能源进行生长。首先甲烷好氧氧化菌利用其所含的甲烷单加氢酶（MMO）将CH4氧化为甲醇，然后在甲醇脱氢酶（MDH）作用下氧化为甲醛，甲醛通过RuMP循环或Serine循环合成细胞物质，或甲醛被进一步氧化为甲酸，最终降解为CO2。由此可见，CH4好氧氧化过程的碳源流向有两个：一方面CH4碳源被同化到土壤微生物中，提高了土壤微生物碳含量，另一方面微生物好氧呼吸将其异化为CO2。本研究中将土壤的13CSOC净增量与13CH4净消耗量相比，计算出试验稻田CH4好氧氧化的固碳效率为51%～66%。与Trimmer等（2015）报道发现英国Chalk河流沉积物的CH4好氧氧化平均固碳效率约为50%的结果相似。然而，有报道发现，在CH4浓度较高的覆盖土中CH4好氧氧化的固碳效率可达69%，而在CH4浓度较低的森林土壤中其固碳效率仅为31%～43%（Roslev et al.，1997）。从功能菌代谢途径来看，以RuMP途径进行碳代谢的II型CH4好氧菌倾向于将较高比例的C-CH4转化到微生物体内，显著高于以Serine途径的I型CH4好氧菌的固碳效率（蔡朝阳等，2016）。可见，稻田中的CH4好氧氧化过程不仅可将CH4转化为增温潜势较小的CO2气体，更重要的是可将一半以上的甲烷碳源同化进入土壤微生物中，促进土壤有机碳累积。

本研究发现，4个处理中非根际土的CH4好氧氧化速率均显著高于根际土，可能与根际微环境中的营养养分水平有关。已有研究发现，水稻光合碳总量的7.6%～23.5%以有机酸（苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等）的形式分泌到根际微域中，为微生物生长提供了一个富碳营养区（Wei et al.，2019）。CH4好氧氧化菌具有底物代谢多样性，可以苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等作为碳源进行合成代谢（Chen et al.，2019）。因此，根际土壤中丰富的有机酸对CH4好氧氧化菌利用CH4分子产生底物竞争，使得本研究中通过CH4浓度变化计算出的CH4好氧氧化速率可能被低估。不仅如此，水稻根系从根际土壤中强烈吸收营养元素磷和钾等，通常造成根际土壤矿质营养元素的普遍匮乏。新近的研究发现，磷缺乏显著降低水稻根际土壤CH4好氧氧化速率及其相关微生物功能基因pmoA的总丰度，改变了I型和II型CH4好氧氧化菌的相对丰度（Gao et al.，2022）。这种效应在NW处理中表现最明显，即在无氮添加条件下非根际土的CH4氧化速率比根际土高出1.27倍，在添加尿素条件下也表现出相同特征。夜间增温可能刺激了水稻根系分泌较多的有机酸，抑制了CH4氧化菌对CH4分子的利用；同时夜间增温有利于水稻根系生长，促进根系对根际土壤营养元素的吸收，从而对CH4氧化菌的矿质营养元素利用造成不利影响。由此可见，水稻根系生长对根际微环境的养分状态产生重要影响，在此生境中CH4好氧氧化过程对环境条件变化（如增温/施硅）表现出较高的响应性。因此，在研究其他环境要素对CH4好氧氧化过程的影响效应时，选用根际土进行分析可能会得出更科学可靠的结论。

CH4好氧氧化作用是微生物驱动的生化过程，凡是影响微生物活性或代谢的环境因素均会对CH4好氧氧化速率产生影响。其中，温度是CH4好氧氧化过程的重要因素之一（郭家宏等，2022）。本研究发现，无氮添加条件下夜间增温抑制了稻田根际土CH4好氧氧化速率，且该速率与土壤有机碳、总氮和活性氮含量等均呈显著正相关。有报道认为，夜间增温会降低水稻根系活力，减少进入土壤的有机碳量，使得根际土壤中甲烷氧化菌所需养分减少，进而降低甲烷氧化菌活性（Zhang et al.，2020）。而且，稻田夜间温度敏感性系数Q10相对于白天更大，说明在夜间增温后微生物活性受温度影响更大（贾庆宇等，2020）。因此，增温导致土壤理化性质发生改变，进而影响CH4好氧氧化微生物的活性可能是本研究夜间增温抑制CH4好氧氧化的主要原因之一。不仅如此，温度升高会使得土壤中其他微生物活性增强和有机物分解速率增加，导致土壤中O2消耗量增大，CO2浓度上升，养分资源匮乏，诱导底物性竞争，最终抑制CH4的好氧氧化（Zhang et al.，2020）。

硅是水稻生长的必需营养元素，有关硅对稻田CH4好氧氧化过程及其功能微生物影响的报道十分鲜见。一般认为，施加硅肥促进水稻叶片的硅化细胞发育，提高光合速率，可将较多的光合产物以根际分泌物方式释放到根际土壤中（张万洋和李小坤，2020）；且对水稻根系生长也有促进作用，可增加水稻根部泌氧能力（Ma，2001）。这将极大改善根际土壤的微生物生长环境，有利于CH4好氧氧化菌活性的提升。本研究发现，施硅稻田根际土壤的CH4好氧氧化速率均高于不施硅稻田，以Si处理最高。此外，施硅与增温处理对CH4好氧氧化速率的影响存在显著的交互作用，表明硅肥对稻田根际土壤CH4好氧氧化过程的促进效应会受到夜间温度变化的强烈影响。尽管如此，NW+Si处理根际的CH4好氧氧化速率显著高于NW处理，表明在夜间增温条件下施硅对CH4好氧氧化速率仍具有促进效应；说明在未来增温背景下施加硅肥可能是促进CH4氧化、缓解CH4排放的有效途径之一。刘燕等（2020）的田间试验结果也表明，在夜间增温条件下，施硅处理的水稻全生育期CH4累计排放量下降39%，说明其CH4好氧氧化速率的提升是全生育期CH4累计排放量下降的主要原因。另一方面，本研究中，Si处理土壤的13C-SOC净增量显著高于其他处理，且施加硅肥处理的CH4好氧氧化固碳效率明显高于不施硅处理。暗示施硅可能改变了土壤中CH4氧化菌的群落结构，更有利于II型CH4好氧菌的生长繁殖，促使较多的CH4碳源被固定到土壤微生物碳中，促进土壤有机碳的累积。

外源氮对CH4好氧氧化过程具有重要影响。本研究中，总体来看，与无氮添加相比，添加3种不同形态氮条件下稻田土壤CH4好氧氧化速率大幅增加，尤其以非根际土更明显。说明施加氮肥可促进稻田的CH4好氧氧化作用。其原因可能是外源氮缓解了微生物细胞生长对氮素的限制，促进了好氧甲烷氧化菌落的活性及相关反应的酶合成。然而有研究表明，由于氮输入的形态、浓度、施肥方法等均会对CH4好氧氧化造成不同影响，所以氮对CH4好氧氧化的研究结果并不一致（Ravishankara et al.，2009；Ettwing et al.，2016）。本研究中，外源氮对稻田CH4好氧氧化速率起促进效应的总体表现为NH4+-N＞Urea＞NO3--N。有研究认为，NH4+-N可与微生物的CH4单加氧酶结合，从而抑制CH4氧化过程（Schimel，2000）。Cai和Mosier（2000）的研究却发现NH4+-N对CH4氧化的抑制作用随CH4浓度的增加而减弱，最终表现为促进CH4氧化。本研究中，CH4底物浓度超过10%，其较高的浓度可能导致外源氮促进CH4氧化过程。在不同处理中，NW+Si处理非根际土对外源氮添加的响应度最高，表明夜间增温背景下，通过合理配施氮肥和硅肥可能是提高稻田CH4氧化速率并异化为CO2的一条有效途径。值得注意的是，外源氮对增温/施硅稻田CH4氧化驱动的固碳净增量无明显影响，导致固碳效率有所下降。这可能是因为外源氮提高了CH4氧化微生物的代谢活性，而未促进微生物繁殖生长所致。所以，综合来看，施加氮条件下，增温/施硅稻田CH4氧化为CO2的潜势大幅提高，而同化到土壤中的13C-SOC固碳量并无明显变化。