薄膜过滤法对5种中药注射液进行无菌检查的探讨

王超之，马帅，付亚冰，高新贞

（1.淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255086；2.淄博高新技术产业开发区生物医药研究院，山东 淄博 255086）

近年来，中药注射液的安全性受到越来越多的关注[1]，本文用来试验的几种注射液其中也有相关不良反应的报道[2-4]，某批次生脉注射液临床患者使用时出现过寒战、发热的不良反应[5]，可能是微生物代谢产生的热原物质引起[6]。生产工艺的无菌保证水平需要通过对药品的无菌检查来确定。注射剂生产过程的无菌检查是保障注射剂质量和安全的重要手段，查阅文献，未检索到参麦、热毒宁、血必净、痰热清和生脉这5 种中药注射液按照《中国药典》2020 版四部进行无菌检查方法验证的文献。本试验通过无菌检查的方法适用性研究，建立这5 种中药注射液的无菌检查方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BMJ-250 霉菌培养箱（上海博迅实业公司医疗设备厂），MJX-250B-Z 霉菌培养箱（上海博迅实业公司医疗设备厂），LMQ.C 立式灭菌器（山东新华医疗设备股份有限公司），BSC-1300IIB2 生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司），HTY-601 集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司），DGB330 薄膜过滤器（浙江泰林生物技术股份有限公司）。

1.2 样品

共检验5 个品种10 个厂家29 批次的样品，详细信息见表1。

表1 试验样品Tab.1 Sample information

1.3 菌种

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus）[CMCC（B）26 003]，枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）[CMCC（B）63 501]，生孢梭菌（Clostridium Sporogenes）[CMCC（B）64 941]，大肠埃希菌（Escherichia Coli）[CMCC（B）44 102].白色念珠菌（Candida Albicans）[CMCC（F）93 001]、黑曲霉（Aspergillus Niger）[CMCC（F）98 003].以上菌种均购自山东省食品药品检验研究院。

1.4 冲洗液与培养基

硫乙醇酸盐流体培养基（批号：7321210918-1，上海诺迪生物科技有限公司），胰酪大豆胨液体培养基（批号：7137210814-1，上海诺迪生物科技有限公司），胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：1105565，广东环凯微生物科技有限公司），沙氏葡萄糖液体培养基（批号：190417，北京陆桥技术股份有限公司），沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：1104575，广东环凯微生物科技有限公司）0.9 % 无菌氯化钠溶液（批号：7C21041703 12，山东齐都药业有限公司）。根据《中国药典》2020年版四部要求检查，培养基的适用性、灵敏度和无菌性均符合要求。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35 ℃培养 18～24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25 ℃培养 2～3天，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25 ℃培养5～7 天，加入适量含0.05%（mL/ mL）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液[7]。菌液计数结果见表2。

表2 菌落计数结果Tab.2 Results of colony enumeration

2.2 方法适用性

2.2.1 试验组

按规定量取每种注射液，照薄膜过滤法不冲洗或用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗100 mL，将硫乙醇酸盐流体培养基100 mL 分别加入3 个滤筒，再分别加入小于 100 cfu 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌菌液； 将胰酪大豆胨液体培养基100 mL 加入其余3 个滤筒，然后分别加入小于100 cfu 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，作为试验组。将加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的过滤器在30～35 ℃培养，逐日观察； 将加入枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的过滤器在20～25 ℃培养，逐日观察。结果见表3。

2.2.2 阳性对照组

另取过滤器，滤筒内不加样品，加入与试验组等体积的相同培养基和等量的菌液，其余操作同试验组。结果见表3。

2.2.3 阴性对照组

另取过滤器，加入与试验组等体积的相同培养基，其余操作同试验组。结果见表3。

表3 方法适用性结果Tab.3 Results of method applicability

2.3 供试品无菌检查

按上述方法适用性试验结果对29 批次样品进行检查。按照药典要求最低检验数量每批次均取15 支样品，用薄膜过滤法分装于3 个滤筒，用金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌。同时做阴性对照试验。试验结果表明在14 天内供试样品均未见菌落出现，符合《中国药典》2020 版规定。

由于样品存在污染不均一的情况，给无菌检查带来局限性[8]。根据数理统计的原理，提高检验数量可提高检出率，按照药典要求最低检验数量的2 倍，即每批次取30 支样品按上述无菌检查法进行检查，试验表明所有样品的无菌检查结果均符合《中国药典》2020 版的规定。

3 结论与讨论

5 种中药注射液均可采用薄膜过滤法进行无菌检查，由于注射液成分不同，其抑菌能力也不同，因此冲洗液用量不同。有的品种药液颜色较深，如不冲洗则会影响结果的观察。综合考虑以上因素，最终确定参麦和生脉注射液不需冲洗，热毒宁、痰热清和血必净注射液用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜。加大取样量1 倍进行检验，提高了无菌检查的检出概率，用此方法检验所有批次样品均合格，说明对药品生产过程的控制尤其是无菌控制水平已较高。

从企业索取得10 份方法适用性资料分析，同品种不同企业间的方法不尽相同，冲洗液用量和种类也存在差异；F 企业的热毒宁注射液企业未使用冲洗液，但其产品药液颜色较深，影响结果观察，用冲洗液冲洗后既可以消除抑菌性也使培养基颜色变浅，使结果更准确；有的验证资料步骤繁琐，如生脉注射液不需冲洗，J 企业用冲洗液冲洗滤膜，容易导致样品污染出现假阳性结果。

根据本文试验结果，同品种且执行相同标准的中药注射液可采用相同的无菌检查方法，这样便于制定更统一详细的执行标准，也有利于中药的质量控制。本试验通过方法适用性研究为5 种中药注射液生产企业无菌检查的方法适用性提供改进的依据，保证检验结果的真实可靠。