水产品中苯甲酸快速检测试纸条的制备

刘丽环，陈纯，黄藤波，曹涛*，李广鹏，李森

（1. 深圳市亿腾检测科技有限公司，广东 深圳 518100；2.广东省检迅检测科技有限公司，广东东莞 523843；3.深圳市深业航天食品与环境检测科技有限公司，广东 深圳 510100；4.深圳市汇知科技有限公司，广东 深圳 518101）

苯甲酸也称安息香酸，属于芳香族酸，白色固体，微溶于水，其抗菌活性主要来源于未离解酸[1,2]。苯甲酸主要用作食品添加剂，具有抑制食品中微生物繁殖、防止食品腐败与变质、保持食品新鲜的作用，苯甲酸及其钠盐均是常用防腐剂之一[3-5]。有研究表明，苯甲酸不会在体内蓄积，但过量添加苯甲酸可能对人体产生毒副作用[6]，苯甲酸能破坏细胞膜有序结构，使膜的功能发生紊乱，扰乱细胞内的各种平衡机制[7]。过量的苯甲酸钠可能会引起腹泻、腹痛和心跳加快等症状[8]。国家标准GB2760-2014《食品添加剂使用标准》对允许使用的食品添加剂的名称、分类、使用范围、使用剂量等都做了明确的说明，规定了苯甲酸及钠盐在22种不同食品中限量标准，限量范围在0.2～2 g/kg不等[9]。

免疫分析方法是利用抗原抗体特异性结合来设计实验，实现对目标分析物的高灵敏、高特异性检测的一种方法。近年来，基于抗原抗体也发展了几种方法用于检测食品中的苯甲酸。其中尤为突出的有荧光偏振免疫分析法和酶联免疫吸附法[10]。虽然基于荧光偏振的方法具有较好的性能，然而该方法需要使用荧光标记的抗原，且需要荧光偏振仪，导致检测成本较高。而对于酶联免疫的方法，样品中基质的干扰对检测结果的影响较大，且需要受过专门训练的人进行操作。本文将利用抗原抗体特异性识别的原理，建立一种基于胶体金的免疫层析试纸条用于对食品中的快速、半定量检测。由于抗体高的特异性及层析试纸条的分离原理，该方法对水产品鱼虾仅需要几步简单处理且便捷、快速、不需要使用昂贵的仪器、无需专业人士操作。因此该方法适用于对食品中苯甲酸的现场筛查。

1 材料和仪器

1.1 主要试剂与材料

氯金酸（AR）、柠檬酸三钠（AR）、吐温（tween)-20（CP）、蔗糖（AR）、聚乙二醇 20000（AR）、叠氮钠（AR）、苯甲酸、苯乙酸、苯酚、苯磺酸、苯丙氨酸购自国药集团化学试剂有限公司；牛血清蛋白（BSA)（BR）、羊抗鼠IgG由美国SIGMA公司分装；样品杯、吸水纸、样品垫、PVC 底板和硝酸纤维素膜（Millipore 135）购自美国Millipore；超纯水由Milli-Q 超纯水系统制备

1.2 主要仪器设备

冷冻离心机购自美国eppendorf；M3 basic涡旋仪和Topolino磁力搅拌购自德国IKA；TP-213 电子天平购自美国DENVER Instrument；DHG-9140A 电热恒温干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司；XYZ3060喷金划膜仪购自美国BioDot；可编程切条机购自杭州峰航科技有限公司；DF-101S恒温加热器购自巩义市予华仪器有限责任公司；冻干机购自美国Labconc；高效液相色谱仪够自日本岛津。

2 试验方法

2.1 胶体金溶液的制备

所有制备的胶体金的玻璃器皿在制备前均需要经酸处理。将所有玻璃器皿用超纯水洗净之后，加入王水涮洗并浸泡2小时，随后冲洗干净，烘干备用。

根据文献采用以下配方制备胶体金[11]。在250 mL圆底烧瓶中加入100 mL 0.1%的氯金酸溶液，在转速为300 rpm的条件下加热至溶液沸腾，加入质量分数为2 mL 1%的柠檬酸三钠溶液，保持温度为在100℃左右10分钟，然后移除加热及搅拌，自然冷却至室温。制备好的胶体金保存于4℃下。

2.2 胶体金的表征

取胶体金于400～700 nm可见光区域扫描其吸光度，并据此判断其尺寸范围。

2.3 胶体金抗体的标记

2.3.1 最佳标记 pH 的确定

在1.5 mL EP管中加入1 mL胶体金溶液，然后分别加入1 mol/L K2CO3溶液调节不同pH(7.5、8、8.5、9)，然后在反应体系加入6 μL浓度为的苯甲酸抗体，混合均匀后静置4小时，然后10000 rpm离心10分钟，取上清液紫外测试。以其OD530值为纵坐标，pH为横坐标，其吸收最大的pH为最佳pH。

2.3.2 胶体金最佳标记蛋白量的确定

在1.5 mL EP管中加入1 mL胶体金溶液，加入1 mol/L K2CO3条件pH 9.0，将纯化后的抗体(1.0 mg/mL)分别取5 uL、10 uL、15 uL、20 uL加入反应体系中，混合均匀后静置4小时，然后10000 rpm离心10分钟。去除上清液，并加入1 mL复溶溶液，于涡旋仪上2500 rpm涡旋30秒，观察上清液及沉淀。出现最少沉淀的为最佳标记条件，若有数个同等条件，则加入蛋白最少量的条件为最佳标记量。

2.3.3 复溶溶液的确定

选 择1 mol/L pH为7.5及8的Tris溶 液，加入0.5%及1%的不同活性剂（BSA， PEG8000，PEG2000，蔗糖，Tween 20）备用。在标记并离心的胶体金沉淀中加入1 mL重悬液，涡旋仪2500 rpm上涡旋30秒，观察上清液及沉淀，沉淀最少，分散时间最短的重悬液为最佳。

2.3.4 标记备用液

综合2.3.1至2.3.3，确认最优条件后，取50 mL胶体金，在涡旋条件下按最佳条件调节pH及标记加入抗体量，静置4小时，并加入终浓度为1%的BSA，涡旋均匀后放入4℃避光保存。

2.4 标记抗体、二抗浓度的选择

抗体标记量及二抗的浓度决定了试纸条的灵敏度。在抗原浓度一定时，胶体金中标记抗体量越少，T线越难显色即越易消带，试纸条的灵敏度越高；反之灵敏度越低。C线的二抗起着参比作用，应根据要求T线的灵敏度来确定。其三者需要比对搭配达到最佳效果。

包被抗原及二抗浓度的选择：取不同量的包被抗原及二抗，喷涂于试纸条上，加入不同含量的苯甲酸进行层析，并根据C线、T线的亮度对比和读数判断其合适浓度。在检测限附近，其读数为0.9～1.1，并且具有较好梯度为宜。

2.5 试纸条的组装

我们选取了流速为80 s/4 cm的硝酸纤维素(NC)膜、样品垫、吸水纸、底板，按照图1的方式搭配起来。

图1 试纸条的组装

2.6 水产品（鱼、虾）的前处理

组织样（虾要去掉头和壳后彻底清洗干净，鱼要去鳞后洗净）应当避光冷藏保存。取切碎的一定量的组织样本，用均质器均质；称取2 g均质于15 mL离心管中；用微量移液器加入4.0 mL乙酸乙酯，然后加入4.0 mL NaOH于15 mL离心管中。剧烈振荡3 min后，室温下4000 r/min离心5 min；用微量移液器移取3 mL上清于15 mL离心管中，用微量移液器加入1.0 mL正己烷，上下颠倒6次，室温4000 r/min离心1 min，用微量移液器移取离心管刻度1.0 ～3.0 mL之间的液体（大约2.0 mL）到新的5mL离心管中，再加入MG氧化剂瓶内的下层黄色液体0.1 mL，混合均匀1分钟后，65℃加热条件下，用空气吹干；用微量移液器向吹干的离心管中加入300 μL复溶液，用微量移液器冲洗溶解试管内壁上残留物；静置2分钟；吸取待检样品溶液100 μL于金标微孔中，用小滴管吹打完全溶解孔内红色物质，等待反应5分钟。

2.7 试纸条性能测试

2.7.1 试纸条灵敏度测试

取苯甲酸标准品，以购买并经高效液相确认为未含苯甲酸草鱼作为基质，加入不同浓度下进行加标实验。所有检测会经过肉眼判断及读数仪读数判定。若T线颜色深度比C线更强，结果为阴性，此时读数仪读数应为1.1以上；若T线颜色深度与C线相当或叫C线弱，则结果为阳性，测试读数仪读数为1.1以下。当T线颜色与C线相当，读数仪读数为0.9～1.1时，其苯甲酸浓度为检测限浓度。若在检测中发现C线无颜色，测试纸条已失效。实验平行进行3次。

2.7.2 试纸条假阳性率、假阴性率测试

取阴性草鱼待检样品溶液200 μL，添加苯甲酸标准品至不同浓度进行加标实验。所有检测经过肉眼及读数仪读数判定，判定标准同上。

2.7.3 试纸条兼容性测试

选取鲫鱼、对虾待检样品溶液，添加苯甲酸标准品至不同浓度进行加标实验，所有检测经过肉眼及读数仪读数判定，判定标准同上。

2.7.4 试纸条交叉反应率测试

选取一个经确认为阴性的草鱼待检样品，分别添加1 mg/L苯甲酸为及10倍量的结构类似物为进行加标实验，结果通过肉眼及读数仪进行读数判定，判定标准同上。

2.7.5 试纸条重复性测试

选取一个经质谱确认为阴性的草鱼待检样品，分别添加苯甲酸为4 mg/L进行加标实验，结果通过肉眼及读数仪进行读数判定，判定标准同上。观察结果稳定性及读数稳定性。

2.7.6 试纸条稳定性测试

试纸条在37℃、50℃分别放置制定天数，选取一个经质谱确认为阴性的草鱼待检样品，分别添加苯甲酸为1 mg/L进行加标实验，结果通过肉眼及读数仪进行读数判定，判定标准同上。观察结果稳定性及读数稳定性。

2.7.7 试纸条与高效液相色谱法的比对

目前，国标采用高效液相色谱进行测定，要确定试纸条的准确性，需要与国标进行比对。在进行液相色谱测试前，需使用苯甲酸标准溶液进行标曲绘制，然后再进行样品测试。

3 结果与讨论

3.1 胶体金的表征

胶体金的尺寸与其颜色相关，尺寸不同，呈现的颜色也不同。尺寸在5～20 nm之间，波长为520 nm，颜色为酒红色；尺寸在20～40 nm之间，波长为530 nm，颜色为深红色；尺寸在60 nm时，溶液主要波长为600 nm，颜色为蓝紫色。

如图2，我们制得的胶体金的紫外图谱最大吸收峰为529 nm，颜色为深红色。根据文献，其尺寸为20～40 nm。

图2 胶体金的紫外吸收光谱

3.2 最佳标记pH的确定

pH对蛋白在胶体金上的标记具有重要影响，当pH不合适时容易造成”死金”现象，即胶体金颜色变灰褐色，如图3。pH从左到右分别为7.5、8.0、8.5、9.0。由图3中可知最佳标记的pH为8.5及9.0。测试其波长在529 nm的吸收值，可见在pH为9.0时，其吸收值最大，说明溶液中的胶体金含量最多，此条件下标记最稳定。

图3 左：pH从左到右分别为7.5，8.0，8.5及9.0 右：不同pH的胶体金吸光度

3.3 最佳抗体蛋白标记量的确定

抗体纯化后浓度稀释为1 mg/mL，在调节至pH为9的1 mL胶体金中分别加入5 μL、10 μL、15 μL、20 μL。稳定后观察现象，结果如图4。当抗体含量逐渐增大，胶体金的颜色出现变化。含量为5 μL、10 μL、15 μL时，胶体金的颜色变化不明显，当抗体含量为20 μL时，胶体金颜色变为灰褐色，即出现死金现象，说明抗体的量过大，使得胶体金团聚，因此抗体标记量不应超过15 μL。随后再将加入5～15 μL抗体的胶体金试管10000 rpm离心10分钟，去除上清液，并加入1 mL重悬液（使用1% tween 20）涡旋，比较溶液颜色。结果如下图4，可见当抗体为15 μL时，胶体金溶液未能完全分散，说明蛋白量过多，而5 μL和10 μL的胶体金可完全重新分散，因此标记量合适。考虑到节约成本的关系，我们最终确定最佳抗体标记量为5 μg/mL。

图4 抗体蛋白标记量（从左到右抗体加入量分别为5 μL，10 μL及15 μL）

3.4 复溶液的确定

复溶液的合适选择可以使得标记后胶体金得到最大程度的回收。往离心后的胶体金沉淀中加入等体积不同复溶液，涡旋后比较不同复溶液中胶体金的分散情况，当所需时间最短，沉淀最少，且无”挂壁”现象(即胶体金黏附于管壁)的为最佳复溶液。比较含量为0.5%～1%的含BSA，PEG8000，PEG2000，蔗糖及Tween 20的pH为9.0的0.5 M Tris 复溶液，效果最佳的为0.5%及1%的Tween 20。因此选用0.5%的Tween 20 pH为9.0的0.5M Tris为复溶液。

综合3.2到3.4，可知胶体金标记的最佳条件为pH为9.0，抗体标记含量为5 μL，复溶液为0.5%的Tween 20 pH为9的0.5 M Tris。

3.5 标记抗体、包被抗原及二抗浓度确定

因试纸条采用比色法，当T线与C线相当或T线比C线颜色弱时，则结果为阳性；当T线比C线深时，结果为阴性。在包被抗原浓度一定时，当二抗浓度越高，C线约亮，结果可能阴性偏高；当标记抗体浓度越高，T线越亮，其阳性结果越难呈现。而当标记抗体的量一定时，包被抗原浓度越高，T线越亮。因此标记抗体、包被抗原浓度及二抗标记浓度决定了试纸条的灵敏度，需要根据目标的检测限配合来调。

本次调试，希望苯甲酸能够将检测限调至1 mg/L。因此，加标浓度选取0.5～4 mg/L。根据之前的筛选，选取最低标记量的5 μL抗体标记于胶体金。

首先，需要筛选合适的包被抗原。目前知道的包被抗原有对氨苯甲酸戊二醛-BSA，对氨苯甲酸N2-BSA，对氨苯甲酸环乳及对羟基苯甲酸-BSA。先选取二抗10 μL、标记抗体10 μL、包被抗原均取5 μL，在试纸条上层析。结果如图5，可知对羟基苯甲酸-BSA显色条带最明显，因此优选为包被抗原。

图5 包被抗原选择图

其次，调整加标条件。选取二抗10 μL，包被抗原选取对羟基苯甲酸-BSA（浓度为1 mg/mL）5 μL。抗体为5 μL，加标分别为0.5 mg/L、1.0 mg/L、4.0 mg/L，结果如图5所示，其C线过亮，T线较弱。因此，需要将二抗浓度降低，并调高T线浓度。因此将二抗调至5 μL，抗体浓度分别为4 μL及8 μL。结果如图6。在标记抗体浓度为6 μL时，加标4 mg/L，T线条带亮度依然较高，因此依然需要配合C线进行调节。但从效果看，已经接近需求范围。

图6 不同添加量T线及C线效果

为了更准确地调试试纸条条件，采用读数仪对试纸条结果进行判读，当读数为0.9～1.1时，为弱阳性；小于0.9时为强阳性，大于1.1时为阴性。图7 A、B及C，C线分别为5 μL、8 μL、10 μL，记抗体分别为6 μL、7 μL及7 μL。比较3图中可见当加标量为1 mg/L时，图B和图C中数值为1.33和0.67，因此理想加标量应该落在两者间。调节条件C线为9 μL，T线为7 μL，得图D，当加标量为1 mg/L时，数值为0.96，落在检出限判读区间。因此确定C线(二抗喷涂量)为9.0 μL，T线（包被抗原喷涂量）为7.0 μL，而胶体金标记抗体量为5.0 μL。确定此条件后，我们进行了小量制备，喷涂2000份测试量进行试纸条性能试验。

图7 不同添加量T线及C线效果及读数

3.6 试纸条性能测试

3.6.1 试纸条灵敏度测试

首先我们进行了加标实验。取阴性草鱼样品，分别按下表加入苯甲酸进行免疫层析测试。所有实验平行进行50次。

根据表1，可见试纸条在加标量为1.0 mg/L时均可以报阳，报阳率100%。因此，其灵敏度可达到目标设定的1.0 mg/L。

表1 苯甲酸试纸条灵敏度测试

3.6.2 试纸条假阳性率，假隐形率测试

取阴性草鱼样品溶液100 μL，分别按下表加入苯甲酸进行免疫层析测试。所有实验平行进行10次。

根据表2，可见试纸条在加标量为1.0 mg/L及更高时均可以报阳，报阳率100%，加标量为0.5 mg/L时均显示阴性，报阴率100%。因此，其假阳性率及假阴性率均为0%。

表2 苯甲酸试纸条假阳性率及假阴性率测试

3.6.3 试纸条交叉反应率测试

试纸条的交叉反应率可以反映试纸条的特异性。取苯甲酸类似物甲苯、苯酚、苯乙酸、苯丙氨酸、苯磺酸，其加标量为苯甲酸的10倍，进行测试，所有测试平行10次。结果见表3。

根据表3，所有类似物在10 mg/L时试纸条均没报阳，只有苯甲酸呈阳性，因此无交叉反应。

表3 苯甲酸试纸条交叉反应率测试

3.6.4 试纸条重复性测试

取阴性草鱼检样品溶液100 μL，按表4添加苯甲酸，共测试30次，观察判读结果。

根据表4，试纸条重现性100%，重复性良好。

表4 苯甲酸试纸条重复性测试

此外，分别购买另外2个鱼类样品（鲫鱼、鲢鱼）和1个虾类样品（对虾），每批次取10个样品，分别为阴性样本及1.0 mg/L添加，进行重复性检测。

结果如表5所示，在不同类别水产品中，试纸条均能检出1.0 mg/L苯甲酸，未添加样品均报阴性，因此试纸条重复性优良。

表5 不同类别水产品苯甲酸重复性检测结果

3.6.5 试纸条稳定性测试

将试纸条分别置于37℃及50℃条件下，对其检测性能进行跟踪。在不同时间抽取装置对样品进行检测，每次检验阴性及阳性样品各5个。结果如下：

从表6可看出，苯甲酸试纸条在37℃可以至少存放35天，50℃可以存放6天左右，拥有足够的稳定性。

表6 苯甲酸试纸条稳定性检测结果

3.6.6 试纸条与高效液相色谱法检测结果比对

目前国标是使用高效液相色谱法（GB 5009.28-2016）。在测试前，先绘制标曲。分别往阴性草鱼中加入苯甲酸含量为0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.5 mg/L、4.0 mg/L及5.0 mg/L，并进行HPLC测试。结果如图8，回归方程为Y＝56749.57X＋247216.42（R2＝0.99899），线性良好，复合要求。接着进行苯甲酸样品测试，添加样品为1 mg/L及阴性样品，分别进行高效液相色谱及试纸条测试，平行重复5次，结果如表7所示，可知试纸条与液相色谱对比具有同样的检出性。

图8 苯甲酸高效液相色谱标准曲线及其图谱

表7 苯甲酸试纸条与高效液相色谱检测结果比对

4 结论

实验选择柠檬酸三钠还原制备胶体金，制备的胶体金粒径为20～40 nm；利用胶体金来标记苯甲酸单克隆抗体，再将BA人工合成抗原（BA-BSA）和羊抗鼠二抗（IgG）分别包被在硝酸纤维素膜的T线和C线处，组装成胶体金免疫层析试纸条；单抗的最佳标记量为5.0 μg/mL，单抗标记最佳的pH为9.0，复溶液为0.5%的Tween 20 pH为9.0的0.5 mol/L Tris；抗原的最佳包被量为7.0 μL，二抗的最佳包被量为9.0 μL，胶体金标记抗体量为5.0 μL，胶体金免疫层析试纸条的目测检测限为1.0 mg/L。试验对苯甲酸试纸条的重复性、稳定性、假阳性及假阴性率的测试验证，结果良好。并研究了几种与苯甲酸结构类似物对试纸条的特异性，实验结果显示：试纸条对甲苯、苯乙酸、苯磺酸、苯丙氨酸等均不发生交叉反应性。将试纸条方法和高效液相色谱法做比较，结果显示试纸条和高效液相色谱法结果一致。