四川泡菜中植物乳杆菌的筛选与鉴定

胡静，黄爱兰，黄顺，徐映红，陈晓嫚，曹凤红，杨俊松，郑志

（1.蚌埠医学院公共基础学院，安徽蚌埠 233030）（2.蚌埠市食品药品检验中心，安徽蚌埠233099）（3.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥 230601）

泡菜具有3 000 多年的悠久历史，享有“川菜之骨”的美称[1]。四川泡菜作为我国传统发酵蔬菜的代表，备受广大民众的喜爱。四川泡菜的原料新鲜，是由乳酸菌发酵制成的盐渍菜，这种“冷加工”的生产方式能够保留蔬菜的营养，维持膳食营养均衡，是一种低热量的食品。传统泡菜属于自然发酵，乳酸菌主要来自原料本身，一般是大白菜、萝卜、豇豆和辣椒等。不同原料携带的乳酸菌种类不同，因此影响泡菜中微生物的构成。乳酸菌不仅赋予食品酸味和香气，改善食品的口味及品质，还具有促进营养物质的吸收、改善肠道功能、降低胆固醇、抗高血压、调节免疫功能及抗肿瘤等生物学作用[2]。研究发现植物乳杆菌和干酪乳杆菌在泡菜的成熟过程中起到决定性的作用[3-5]。植物乳杆菌作为乳酸菌中的一员，在自然界中分布广泛，存在于人类和昆虫的肠道，乳制品，水果和蔬菜[6,7]，具有较强的糖代谢能力，在泡菜发酵中后期，随着氧气的消耗殆尽，植物乳杆菌开始在发酵过程中起主导作用，利用反应体系中的糖类代谢产生大量的酸，从而加速泡菜的成熟过程[8]。此外，植物乳杆菌降胆固醇的效果显著，如Lactobacillus plantarumNCU116 可将高脂喂养小鼠的胆固醇水平明显降低[9,10]。植物乳杆菌可以调节肠道疾病，因其能够分泌抑制病原菌生长的抗菌肽、有机酸和细菌素等物质；也能够分泌胞外多糖起到抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等作用[11-13]。植物乳杆菌，作为一种益生菌，被广泛应用于食品生产中，如酸奶、豆乳、干酪及饮料等。植物乳杆菌可以赋予产品良好的风味、质地，及保健功能。

随着科学技术的发展，人民生活质量的提高，人们更青睐于健康养生的生活理念。由于益生菌有益健康，近年来我国对益生菌产品的需求猛增，益生菌产业呈现井喷式发展，益生菌市场发展前景巨大。植物乳杆菌在发酵乳中，最成功的应用当属光明专利菌株-“植物乳杆菌ST-III”，光明“畅优”和“植物活力”乳酸菌饮料中都添加了该菌株，成为“通畅型酸奶的第一品牌”。此外，“植益”采用植物乳杆菌LP28 发酵，2015年在乳酸菌企业中脱颖而出。因此，筛选具有良好益生功能的乳酸菌具有很重要的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

泡菜来自四川的成都、达州、眉州，传统自然发酵制作；MRS 琼脂和MRS 肉汤，青岛海博生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒、Taq PCR Mix、溶菌酶溶液、GeneGreen 核酸染料，北京天根生化科技（北京）有限公司；DL10000 DNA Marker，Takara；VITRK 2棒状杆菌鉴定卡（CBC），上海嘉合生物科技有限公司；革兰氏染色试剂盒，南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

振荡培养箱、生化培养箱，江苏科析；立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯；PCR 仪，德国Eppendorf；DNA 电泳槽，北京六一仪器；超净工作台，苏州净化；VITEK 2 Compact 仪器，法国梅里埃；凝胶成像系统，伯乐公司（Bio-Rad）；生物显微镜，日本奥林巴斯。

1.3 实验方法

1.3.1 乳杆菌的分离纯化

分离纯化流程见下：

泡菜汁液1 mL+19 mL 的无菌生理盐水→置于振荡培养箱中，室温下200 r/min 培养过夜→取样液1 mL，用无菌的生理盐水进行10 倍梯度稀释→取稀释了102、103、104的样液100 μL 涂布平板→37 ℃倒置培养48 h

菌株经过多次划线，以获得纯菌株。选取白色、圆形、表面光滑凸起的菌落，进行革兰氏染色。

1.3.2 生理生化反应鉴定

使用VITEK 2 棒状杆菌鉴定卡（CBC）进行测定。CBC 卡是基于已经确定的生化方法和新开发的底物，用来检测碳源利用和酶类活性。共有41 种生化反应，具体内容见表1，获得最终鉴定结果大约需要8 h。具体操作方法为：向透明的塑料试管（聚苯乙烯材质，12 mm×75 mm）加入3.0 mL 无菌盐水（w=0.45%～0.5%的NaCl 溶液，pH 值为4.5～7.0）。用无菌接种环刮取适量的菌落加到试管中，为了菌体更好的分散于盐水中，可将菌体在管壁上充分研磨制备菌悬液。VITEK 2 DensiCHEK 仪器先经过校准，然后检测菌液浓度，检测浓度为McFarland No.2.7～3.30。然后将CBC 卡放入试管中，置于卡架中以备检测。注意，CBC 卡片放入前，菌悬液配制时间不能超过30 min。

表1 CBC 反应孔内容物Table 1 The contents of CBC reaction pore

1.3.3 16S rRNA 序列扩增、鉴定

挑一单菌落至MRS 肉汤过夜培养（37 ℃，14～16 h）。取2 mL 菌液离心，去上清，用菌体提取基因组。扩增保守基因16S rRNA。使用引物序列为27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’ ）和 1495R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’），目的片段长度约1 500 bp。PCR 反应体系为见表2。

表2 PCR 反应体系Table 2 Amplification system of PCR

PCR 扩增程序为：

PCR 产物经1%琼脂糖电泳检测后，送华大基因测序。

1.3.4 系统进化分析

测得的序列先在 NCBI 上进行 Nucleotide BLAST，以＞99%为界线，判断是否是植物乳杆菌。从NCBI 网站上下载已有的植物乳杆菌序列及其他乳酸菌模式菌株序列，使用邻接法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与鉴定

从5份泡菜样本中分离获得40个菌株，选取圆形、乳白色、表面光滑凸起、边缘整齐、不透明的菌落。多次划线获得纯菌株。经革兰氏染色后均为紫色，呈杆状或棒状。（见图1）。

图1 14 号菌株菌落形态及其菌体镜检结果（1000×）Fig.1 The colony morphology of No.14 strain and its micrograph after Gram staining (1000×)

2.2 生理生化反应结果

使用CBC 鉴定卡鉴定了20 个菌株，其中可能性概率在96%～99%的，置信水平为“极好”，总共有7个株菌，其中6 个菌株（1 号、2 号、5 号、15 号、17 号、20 号）鉴定为植物乳杆菌（29 号为杰氏棒杆菌）；可能性概率在93%～95%的，置信水平为“非常好”，有2 个菌株，即6 号和14 号菌株；可能性概率在89%～92%的，置信水平为“好”，有2 个菌株，即4 号和38 号菌株；可能性概率在85%～88%的，置信水平为“可接受”，有2 个菌株，即7 号和23 号菌株。总体来说，20 个CBC 反应卡的结果中有12 个菌株的反应结果可以鉴定为植物乳杆菌（见表3）。CBC 鉴定卡在鉴定植物乳杆菌方面的研究较少，传统的乳酸菌的生化鉴定方法多是鉴定一些糖及醇的反应，另外还需做明胶液化试验、吲哚试验、V-P 试验等多个试验，但是只能鉴定到“属”，很难确定到“种”[14,15]。而CBC 鉴定卡可以直接鉴定到“种”，缺点是价格贵，必须依赖于VITEK 2 Compact 仪器操作，但是操作方法简单。另外API 50 CHL 主要用于鉴定乳杆菌，而且不需要依赖于仪器，可以手工操作，涉及50 个生化反应，记录反应结果即可查询被鉴定细菌的种名，但是价格更昂贵，而且货期很长，不易购买。虽然CBC卡主要是鉴定棒状杆菌，但是也可以鉴定植物乳杆菌，因此，综合考虑选用CBC 鉴定卡筛选植物乳杆菌。

表3 CBC 卡生化反应鉴定结果Table 3 The identification results from CBC card biochemical reactions

2.3 16S rRNA 序列扩增结果

琼脂糖凝胶电泳结果显示，成功扩增出目的片段。将PCR 扩增成功的产物送到华大基因测序，进行双向测通。拼接后的序列，在NCBI 网站上进行Nucleotide BLAST 同源性比对，发现所有的菌株都属于乳杆菌属，同源性达到100%。但是不限于植物乳杆菌，有的显示是戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）或其他乳杆菌（Lactobacillussp）。因此，还需构建系统发育树进一步确认。

图2 各菌株16S rRNA 基因琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis pictures of 16S rRNA gene of each strain

2.4 系统发育分析

系统发育树构建的软件不断推陈出新，大体上如下几种选择策略，有简单的UPGMA 法、邻接法（Neighbour-joining，NJ）、最大简约法、最大似然法以及贝叶斯法，每种方法都有不少可选择的工具。由于扩增的16S rRNA 序列较短，本研究选用MEGA7.0软件采用邻接法构建系统发育树。

由图3 中的NJ 树可知，所有的序列聚为三簇，经CBC 卡初步鉴定为植物乳杆菌的12 个菌株序列，与已知的植物乳杆菌的序列聚为一簇（Cluster 1）；其中6 号菌株与L.plantarum3356 聚为一支，亲缘关系更近，其次是20 号菌株；由于Bootstrap 的值＞70%，构建的进化树才可靠，因此17 号菌株与L.plantarumJCM1149 虽然聚为一支，但结果不可靠；4、5、14、15、23 和38 号菌株与L.plantarumNCU116、L.plantarumMBEL2169、L.plantarumAN7 等序列相似性极高，无遗传距离；Cluster 1 的所有菌株与消化乳杆菌（L.alimentariusDCM20249）亲缘关系近。此进化树以乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）作为异源参照菌株。

图3 泡菜样品中分离的代表菌株和模式菌株基于16S rRAN 的系统发育树（NJ 法）Fig.3 The phylogenetic tree based on 16S rRAN of representative strains isolated from pickle samples and type strains (NJ method)

鉴于本实验主要筛选的是植物乳杆菌，因此只选用了MRS 琼脂培养基进行筛选，而CBC 卡不能鉴定乳球菌和明串珠菌，所以没有筛选到泡菜中常有的乳球菌和明串珠菌等菌株。本研究中分离到的乳酸菌中80%是植物乳杆菌，是四川泡菜中的优势菌种，这与前人的研究结果一致[16-18]。短乳杆菌（LB.brevis）在泡菜中也常见，由于CBC 鉴定卡不能鉴定LB.brevis，因此在初筛过程中也被淘汰。

3 结论

传统泡菜样品中乳酸菌种类繁多，本研究从四份泡菜样本中共挑选40 个菌株，经革兰氏染色和菌落形态观察后，挑选了20 个菌株，使用VITEK 2 棒状杆菌鉴定卡（CBC）进行生化反应鉴定，其中有12 个菌株初步鉴定为植物乳杆菌（可能性≥85%）。这些菌株经16S rRNA 基因测序、Nucleotide BLAST 比对，均为植物乳杆菌。然后，利用已知植物乳杆菌序列和泡菜中检出的一些模式菌株序列使用邻接法构建系统进化树，12 个菌株序列与已知的植物乳杆菌序列聚为一簇，甚至有的序列高度相似，无遗传距离。综合所有的鉴定结果，我们认为筛选的12 个菌株均为植物乳杆菌。CBC 鉴定卡是初筛植物乳杆菌较好的方法。