灵芝HPLC指纹图谱研究及其在产地追溯中的应用

汪丽娜,蒋昆霞,关梦瑶,许 文,徐 伟,林 羽

(福建中医药大学药学院,福建 福州 350122)

灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.)Karst.或紫芝GanodermasinenceZhao,Xu et Zhang的干燥子实体[1],具有平喘止咳、安神补气等功效[2-3]。福建是灵芝的主产地之一,福建灵芝入选福九味,为福建省重点名贵道地药材之一[4]。中药指纹图谱是一种广泛用于整体反应中药材质量的方法[5-6],灵芝种类繁多,不同产区灵芝的成分及含量相差较大,利用中药指纹图谱可以标识不同产地灵芝共有峰,为区分不同产区的灵芝提供方法。查阅灵芝指纹图谱文献,许晓燕等[7]建立了四川产地灵芝的14个HPLC共有峰;赵如诗等[8]建立了安徽、吉林等4个产地灵芝10个HPLC特征峰;Da等[9]建立安徽、山东等7个产地灵芝24个HPLC共有峰;Chen等[10]构建了浙江、山东和安徽产地灵芝29个HPLC共有峰。然而,基于HPLC指纹图谱法应用于灵芝药材溯源中的研究报道较少,因此本研究以福建灵芝为主要的溯源研究对象,构建灵芝HPLC指纹图谱,为灵芝的道地追溯提供新的技术手段。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1290超高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),EX225DZH/AD十万分之一分析天平(奥豪斯仪器有限公司),MILLI-Q Direct16超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 药品与试剂

灵芝酸F(宝鸡市辰光生物科技有限公司,批号:HS18048S1,纯度≥98%,HPLC)。甲醇、乙腈、甲酸、乙醇(色谱纯),其余试剂均为分析纯。

1.3 药材

32批灵芝药材饮片(S1-S32),分别购自福建、浙江、安徽、吉林,经福建中医药大学药学院范世明正高级实验师鉴定为赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的干燥子实体。

2 方法

2.1 色谱方法

色谱柱采用Thermo Scirntific AcclaimTMRSLC PA2 Polar AdvantageⅡ(2.1 mm×150 mm,2.2μm),流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸(B),流速:0.25 mL·min-1,梯度程序为(B):0～34 min,26.5%～26.5%;34～52 min,26.5%～38.5%;52～60 min,38.5%～55%;60～75 min,55%～90%;75～80 min,90%～20%;80～90 min,20%～20%,柱温:30℃,检测波长:257 nm,进样量:5 μL。

2.2 供试品及对照品溶液的制备

取灵芝酸F对照品适量,精密称定,加入甲醇分别制成质量浓度约为1 mg·mL-1的对照品储存液。

精密称定灵芝药材粗粉约1.0 g于具塞锥形瓶中,精密加95%乙醇50 mL,密塞,称量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放冷,用提取溶液补失重,摇匀,过0.22 μm滤膜,精密移取2 mL滤液于蒸发皿蒸干,精密加入50%甲醇0.5 mL复溶,过0.22 μm滤膜,取续滤液即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取灵芝药材(S12),采用“2.2”项的方法制样,“2.1”项条件下连续进样6次,以灵芝酸F为参照,记录各指纹峰相对保留时间与相对峰面积,两者RSD均小于2.7%,表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取灵芝药材(S12),采用“2.2”项的方法制样,在“2.1”项条件下别于0、2、4、8、12、24 h进样,以灵芝酸F为参照,记录各指纹峰相对保留时间与相对峰面积,两者RSD均小于3.5%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取灵芝药材(S12)6份,采用“2.2”项的方法制样,在“2.1”项条件下进样,以灵芝酸F为参照,记录各指纹峰相对保留时间与相对峰面积,两者RSD均小于4.7%,表明该方法重复性良好。

3 结果与分析

3.1 灵芝药材HPLC指纹图谱共有模式的建立

取18批福建灵芝样品(S1-S18)和14批其他产区样品(S19-S32),分别按“2.2”项下制备样品,按“2.1”项下条件进样采集数据。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)[11],对福建灵芝以及其他产区样品的HPLC指纹图谱进行分析,以灵芝酸F为参照,福建灵芝样品(S1-S18)在共有模式中共建立了46个共有峰,其他产区样品(S19-S32)共建立了23个共有峰,见图1和图2。

图1 福建灵芝样品HPLC指纹图谱

图2 其他产区灵芝样品HPLC指纹图谱

3.2 化学计量学分析

为了进一步区分福建灵芝样品与其他产区灵芝样品的区别,以灵芝酸F为参照峰,对所有峰面积进行相对峰面积的标准化处理(Z标准化)后导入SPSS 26.0和SIMCA-P14.0进行化学计量学分析,采用聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)进行化学计量分析。

3.2.1 聚类分析

将32批灵芝样品18个共有峰面积导入SPSS 26.0版软件进行PCA,以瓦尔德及欧氏距离作为样品间距离计算方法,见图3。结果显示,当聚类距离为25时,32批灵芝被分为两类,第1类为福建灵芝样品,第2类为其他产区样品。当聚类距离为12时,32批样品划分成4类,第1类为福建产地样品,第2类为浙江产地灵芝,第3类为安徽产地灵芝,第4类为吉林产地灵芝。结果表明,分类情况与产地有关。

图3 聚类分析

3.2.2 主成分分析和正交偏最小二乘法分析

将18个共有峰数据导入SPSS 26.0软件,计算特征值和方差贡献率,见表1,成分矩阵见表2。将特征值>1的成分提取出来,由表1、2可知,主成分1-4累积方差贡献率为85.24%>85%,表明这4个主成分能较全面反映所有指标的信息。主成分1的特征值为9.257,方差贡献率为51.428%,载荷较高的峰为1号峰和6号峰,表明1号峰和6号峰主要反映主成分1的信息;主成分2的特征值为3.491,方差贡献率为19.394%,载荷较高的峰为8号峰和9号峰,表明8号峰和9号峰主要反映主成分2的信息;主成分3的特征值为1.515,方差贡献率为8.414%,载荷较高的峰为16号峰和17号峰,表明16号峰和17号峰主要反映主成分3的信息;主成分4的特征值为1.081,方差贡献率为6.003%,载荷较高的峰为4号峰和18号峰,表明4号峰和18号峰主要反映主成分4的信息。由表1与图4可知,主成分1-4特征值均大于1,其累积方差贡献率为85.239%,表明上述4个主成分为不同产地灵芝质量差异的主要成分。

表1 特征值和方差贡献率

表2 灵芝药材成分矩阵

图4 碎石图

利用SIMCA-P 14.0软件进行PCA,将32批灵芝药材中18个共有峰的数据带入软件,见图5。32批4个产地的灵芝药材各自聚为一类,与PCA结果一致。福建产区的灵芝整体分布较为集中,可与其他3个产地完全分开,吉林产区的灵芝样品分布较为离散。进一步利用OPLS-DA,将VIP大于1作为提取评价标准[12],见图6。结果显示,色谱峰3、4、5、6、8、9、18的VIP值均>1,表明这7个峰所指代的成分是区别不同产地灵芝差异的主要标志性成分。

图5 主成分分析注:FZ:福建,ZJ:浙江;AH:安徽;JL:吉林

图6 偏最小二乘法分析注:FZ:福建,ZJ:浙江;AH:安徽;JL:吉林

4 讨论

在预实验期间,笔者比较了超声、回流、索式提取、温浸提取等提取方式,结果发现,超声、回流这两种提取方式的效果优于索式提取和温浸提取,考虑操作简便性,本实验选择较便捷的超声提取法来制备灵芝供试品。

本实验建立福建灵芝样品HPLC指纹图谱共标定46个共有峰,其他产区样品药材HPLC指纹图谱共标定23个共有峰,为了进一步区分福建灵芝样品与其他产区灵芝样品的区别,以灵芝酸F为参照峰,对所有峰面积进行相对峰面积的标准化处理(Z标准化)后导入SPSS26.0和SIMCA-P14.0进行化学计量学分析,并进行指纹图谱的HCA、PCA、OPLS-DA,实现了福建灵芝的有效溯源,在具体使用过程中将灵芝药材样品指纹图谱信息导入已建立好的HCA模型、PCA模型和OPLS-DA模型中,将灵芝药材样品与模型进行比对,共有色谱峰3、4、5、6、8、9、18是影响不同产地灵芝差异的主要标志性成分,从而有效追溯福建灵芝样品。

综上,本研究构建了灵芝HPLC指纹图谱,结合HCA模型、PCA模型和OPLS-DA模型,可快捷、准确地应用到灵芝产地追溯,为灵芝的质量追溯提供新的技术手段。