血清CTCs、hs-CRP水平与肝癌手术患者预后的相关性研究

邱泽成，陈斌，林燕凤，李柳生，陈健健，王仕佳，黄雄沛

（广东省茂名市人民医院 肝胆胰肛肠外科，广东 茂名 525000）

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤疾病之一，其发病率逐年升高。临床研究显示，患者行肝癌根治术后5 年的复发率超过60%，由于肿瘤细胞转移常常导致预后不佳，近年来死亡率也居高不下［1］。目前，术前尚无确切的生物学指标可提示术后复发及预后情况，而术后则常采用腹部超声及血清甲胎蛋白（AFP）对肝癌预后进行监测，但不能准确地提示早期复发时间点，也不能精准地给予干预治疗，存在一定的局限性［2］。因此，若能寻找经济、实用、准确性高的指标，改善肝癌患者术后预后，将产生极大的经济效益，降低医疗费用，提高肝癌疾病的治愈率。研究证实肝癌细胞会释放进入血液循环系统，称为循环肿瘤细胞（CTCs），并存储在各个器官，从而发生远处转移，或者返回残肝脏或新生的健康肝脏，而从导致肝内复发。CTCs 计数和分子特征的鉴定可以为监测肝癌患者的复发转移、个体化治疗方案及判断预后提供依据［3］。超敏C 反应蛋白（hs-CRP）虽非肿瘤标志物，但在肿瘤发生时常有升高［4］。本研究尝试通过联合检测两指标，希望提高对肝癌术后复发判断，包括复发高危度、时间点、治疗效果、耐药性。基于此，本研究测定了手术前后患者CTSs 和hs-CRP 水平变化，探究术前术后CTCs 数量、hs-CRP 水平与术后肝癌复发的关系，并对肝癌预后复发情况进行联合预测分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取广东省茂名市人民医院2017 年12 月至2019 年12 月收治的60 例原发性肝癌患者作为研究对象。60 例肝癌患者男38例，女22例，年龄52～79岁，平均（64.38±11.24）岁。同时，选取30 例健康体检者作为对照，无肝癌等恶性肿瘤、心血管疾病、肝肾等器质性病变健康体检者；其中男17例，女13例，年龄48～74岁，平均（60.15±9.54）岁，。

纳入标准［5-6］：①术前影像学检查均未见肿瘤肝外转移灶，且术后均经病理检查明确诊断；②术前美国麻醉师协会（ASA）评分Ⅰ～Ⅱ级者；③均签署知情同意书，自愿参加者。排除标准：①合并其他恶性肿瘤或自身免疫疾病者；②合并心血管疾病者；③不配合检查，中途退出者。

1.2 检测指标

术前及术后1 周采集静脉血10 mL 应用CanPatrol 检测外周血中CTCs 数量及分型。采取利用CanPatroTM-CTC-二代捕获技术联合RNA 多重原位杂交分析测定CTCs 数量［78］。具体如下：采集血样后，离心去除上清液，固定剂固定8 min；连接真空泵，将样品液体转移至过滤器，完成肿瘤细胞纳米技术截留与富集，甲醛溶液固定60 min后PBS 洗涤晾干。再根据CanPatro-CTC-二代捕获技术及RNA-ISH 试剂盒说明书进行RNA 多重原位杂交分析检测。

术前及术后1 周采集静脉血2 mL，3 000 r/min离心10 min 后取上清液，采用放免法，全自动生化分析仪检测hs-CRP 和AFP。

随访情况：术后第1 年每个月、术后第2 年后每2 个月采集静脉血进行复查，包括hs-CRP、AFP、肝功能，同时还配合影像学检查如肝脏B超、CT、MRI 或血管造影等。当患者AFP 水平异常增高时，复查随访则改为每个月1次，若确诊为肝癌复发，则取血样再次进行CTCs 测定。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件对数据进行分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，组间差异采用独立样本t检验分析；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。同时，采用一元线性回归分析评估CTCs 数量、hs-CRP 水平与术后肝癌复发的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康对照者与肝癌患者手术前后CTCs 数量及hs-CRP 水平比较

术前，肝癌患者CTCs、hs-CRP 及AFP 水平显著高于健康者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。术后，肝癌患者CTCs、hs-CRP 及AFP 水平较术前均显著降低（P＜0.05），但仍高于健康人群，其中CTCs 数量与健康对照者比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 健康对照者与肝癌患者手术前后CTCs 数量及hs-CRP 水平分析（）

表1 健康对照者与肝癌患者手术前后CTCs 数量及hs-CRP 水平分析（）

注：1）与健康对照比较，P＜0.05；2）与术前比较，P＜0.05。

2.2 术后肝癌患者随访情况分析

随访时间截止到2019 年12 月31日，随访时间为7～20 个月，中位随访时间为12.76 个月。复查确诊术后肝癌复发患者32例，其中男18例，女13例，年龄54～76岁，平均（62.77±8.95）岁。复发时AFP≥100 ng/mL 阳性患者23例，AFP＜20 ng/mL 阴性患者9例，复发时间5～16 个月，平均11.45 个月。

2.3 确诊肝癌患者手术前后及复发时CTCs 数量及hs-CRP 水平变化

术后1周，肝癌患者CTCs、hs-CRP 及AFP 水平明显低于术前，差异均有统计学意义（P＜0.05）。确诊复发时，患者CTCs、hs-CRP 及AFP 水平较术后1 周均有显著升高（P＜0.05），但仍低于术前水平；其中CTCs 及AFP 与术前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 术前、术后1 周及确诊复发时肝癌患者血清CTCs、hs-CRP 和APF 水平变化（n=32,）

表2 术前、术后1 周及确诊复发时肝癌患者血清CTCs、hs-CRP 和APF 水平变化（n=32,）

注：1）与术前比较，P＜0.05；2）与术后比较，P＜0.05。

2.4 肝癌复发患者术前及术后CTCs、hs-CRP水平与复发时AFP 相关性分析

肝癌复发患者术前的CTCs 数量与复发时肿瘤标志物AFP 水平呈正相关（R2=0.775,P＜0.001），且术后CTCs 数量虽有所降低，但仍与AFP 水平明显正相关（R2=0.587,P＜0.001）。同时，肝癌复发患者术前的hs-CRP 水平与复发时AFP 表现正相关（R2=0.673,P＜0.001）；且术后hs-CRP 水平也与AFP 呈正相关（R2=0.788,P＜0.001）。见图1。

图1 术前及术后肝癌复发患者CTCs、hs-CRP 水平与复发时AFP 相关性

2.5 肝癌复发患者复发时CTCs、hs-CRP 水平与复发时AFP 相关性分析

如图2 所示，肝癌患者复发时，血样中CTCs数量与肿瘤标志物AFP 水平明显正相关（R2=0.574,P＜0.001），血清hs-CRP 含量也与AFP 呈正相关（R2=0.809,P＜0.001）。

图2 肝癌复发患者复发时CTCs、hs-CRP 水平与复发时AFP 相关性

3 讨论

肝癌作为临床常见恶性肿瘤之一，严重威胁患者生命健康安全。目前临床多采取根治切除术进行治疗，具有良好的临床疗效。但是大量临床实践表明，行肝癌切除术后较易出现肝癌组织转移及复发。因此，如何早期有效预测肝癌复发及转移成为影响肝癌患者预后重要因素，寻找肝癌复发及转移的预后因子成为近年临床关注的热点。目前，临床多采取AFP 作为肝癌复发及转移诊断重要指标，但有研究报道发现，仍有30%～40%的肝癌患者血清AFP 呈阴性，其特异性和敏感性尚有待提高［9］。相关报道指出，肿瘤细胞转移与CTCs 数量存在一定相关性，且肝癌患者hs-CRP水平随着肝癌组织转移损伤肝细胞诱发炎症反应而表达增加［10-11］。但目前尚未见联合CTCs 数量及hs-CRP 水平联合预测肝癌术后复发。本研究尝试研究肝癌患者CTCs 数量、hs-CRP 水平与术后肝癌复发的关系，并对肝癌预后复发情况进行联合预测分析。

AFP 作为肝癌的重要肿瘤标志物，在辅助诊断具有重要地位，也常用于预后评估［12］。本文结果发现，复查确诊术后肝癌复发患者32例，复发时AFP≥100 ng/mL 患者23例，AFP＜20 ng/mL 患者9例，表明仅依据AFP 作为判断肝癌复发的指标检出率有限，易出现漏诊［2,7］。检测肝癌患者术前、术后及复发时CTCs、hs-CRP 水平发现，肝癌患者术前CTCs、hs-CRP 均显著高于健康人群（P＜0.05）；而术后，CTCs 及hs-CRP 水平较术前有明显降低（P＜0.05）。这是因为术前肝癌细胞释放并进入血液循环系统及淋巴系统，使得循环系统存在CTCs；且大量研究证实，恶性肿瘤的发展与机体炎性反应密切相关，肝癌肿瘤细胞在增殖、转移过程中，侵袭周围正常组织，造成细胞损伤、凋亡，激活炎症反应，hs-CRP、肿瘤坏死因子（TNF-α）等炎性介质释放，机体表现为微炎症状［13-14］。然而，确诊复发时，患者CTCs、hs-CRP显著高于术后1周，这提示肝癌患者CTCs 数量及hs-CRP 水平随着癌细胞的转移或癌变复发而增加。CTCs 具有一定的侵袭性，经循环系统回到肝脏靶器官后，会黏附并聚集后形成微小癌栓，在适当条件下，再次发生间质-上皮化形成新生肿瘤组织，导致肝癌组织复发或转移［15-16］。因此，若肝癌患者术后CTCs 升高，则表示肿瘤细胞可能转移，肝癌有复发的风险，可应用该指标对肝癌患者术后复发进行早期诊断及预后评估，这与刘子鑫等［15］的研究结果一致。伴随患者术后肝癌复发，肿瘤细胞增殖或肝组织坏死受损均可导致炎症反应过度激活，炎症因子hs-CRP 表达上调［16］，因此可联合hs-CRP 评估肝癌患者预后复发状况。

为了进一步探究肝癌患者CTCs 数量及hs-CRP 水平与患者肿瘤标志物AFP 关系，本研究同时分析了术前，术后及确诊时相关指标与肝癌预后复发的相关性。结果显示，肝癌复发患者术前、术后及复发确诊时血清CTCs 数量及hs-CRP 水平均与肿瘤标志物AFP 呈正相关（P＜0.001）。这表明血清CTCs 及hs-CRP 水平越高，机体肿瘤标志物AFP 越高，肝癌转移及复发倾向越高，这与袁林、肖潇等［17-18］的报道类似。CTCs 和hs-CRP 可和AFP 一样作为肝癌诊疗的标志物，辅助预后诊断，尤其是肝癌术后，监测AFP 同时还要测定联合测定CTCs 及hs-CRP，帮助了解病情进展，针对可能的结果及早进行医学干预，减少肝癌复发。本研究仍有不足之处，入选样本例数较少，随访时间不长，后续会加大样本量，延长随访时间，以评估患者生存期和长期预后情况。

综上所述，术前肝癌患者CTCs 及hs-CRP 水平显著高于术后，而复发时CTCs 及hs-CRP 又明显高于术后水平；且肝癌复发患者术前、术后及复发时，CTCs 数量及hs-CRP 水平与肿瘤标志物AFP 均呈正相关。术后复查可联合检测患者CTCs数量及hs-CRP 水平，帮助预测肝癌预后复发情况，促进临床诊疗。