基于HPLC-QAMS多指标成分定量测定联合化学计量学的津力达颗粒质量评价*

王玉娟，董玉波，孙莎莎，宁丽丽，任强，周金辉

（1.中国人民解放军第960医院，山东 济南 250031；2.济宁医学院药学院，山东 日照 276826）

糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，可导致眼、肾、神经等多种组织器官出现慢性进行性病变、功能减退甚至衰竭，是危害人类生命健康的常见疾病之一。部分中药能够有效改善糖尿病患者的临床症状，其有效活性成分能够抑制ɑ-葡萄糖苷酶活性和糖异生，促进糖原合成和胰岛素分泌，增加血清胰岛素含量，通过多靶点调控血糖，不良反应小，且近年来已广泛应用于糖尿病的治疗中[1-2]。津力达颗粒由人参、黄精、麦冬、葛根、生地黄、炒苍术、苦参、制何首乌等中药材加工而成，主要用于治疗2型糖尿病气阴两虚证。现代研究表明津力达颗粒能有效改善糖尿病肾病患者肾功能，调节VEGF和IGF-1水平[3]，通过激活FGF21/AMPK信号通路改善肝脏、脂肪组织脂质及高脂饮食诱导的代谢紊乱[4]。研究表明，津力达颗粒治疗2型糖尿病临床疗效显著[5-6]，临床应用广泛，为临床常用药物。津力达颗粒收载于2020年版《中华人民共和国药典》一部[7]，质量标准和现有文献[8-9]仅对该制剂所含苦参碱等成分进行定量分析。对多成分、多靶点的中成药复方制剂而言，现有的控制措施难以确保产品质量的稳定性和临床治疗效果的一致性。而多指标质控模式能够较为全面地体现中成药复方制剂的整体性和系统性，近年来得以广泛应用，同时化学计量学也越来越多地应用于中药制剂的分析[10-11]。本研究参考中药质量标志物选取原则，以葛根素为内参物，采用高效液相一测多评（high performance liquid chromatographyquantitative analysis of multi-components by single-marker，HPLC-QAMS）法同时检测对津力达颗粒中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、3′-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、苍术素醇、白术内酯Ⅱ和苍术素的含量，建立津力达颗粒多指标质量评价模式，同时对15批津力达颗粒含量数据采用化学计量学方法进行聚类分析和主成分分析，以期为药品生产企业和监管部门全面评价和提升津力达颗粒的内在质量提供实验数据。

1 材 料

1.1 试药 人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-202129，含量：94.3%）、人参皂苷Rb3对照品（批号：111686-202005，含量：96.5%）、人参皂苷Rd对照品（批号：111818-202104，含量：97.3%）、葛根素对照品（批号：110752-201816，含量：95.4%）、毛蕊花糖苷对照品（批号：111530-201914，含量：95.2%）、白术内酯Ⅱ对照品（批号：111976-201501，含量：99.9%）和苍术素对照品（批号：111924-201806，含量：99.5%）均购自中国食品药品检定研究院；3′-羟基葛根素对照品（批号：PRF21101341，含量：98.0%）、3'-甲氧基葛根素对照品（批号：PRF9092003，含量：97.1%）、焦地黄苯乙醇苷B1对照品（批号：PRF7041822，含量：98.5%）均购自成都普瑞法科技开发有限公司；苍术素醇对照品（批号：JD1227180626，含量：98.5%）购自上海珈得尔化学技术有限公司；津力达颗粒（9 g/袋，批号：B1908001，B1909002，B1910009，B1910012，B2003031，B2004002，B2007025，B2010007，B2011012，B2011015，B2102004，B2103009，B2104012，B2106002和B2108001）购自石家庄以岭药业股份有限公司，编号依次为S1～S15。乙腈选用色谱级，其他试剂均选用分析纯。

1.2 主要仪器 UltiMate 3000型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Perkin Elmer Series 200型高效液相色谱仪（Perkin Elmer公司）；Waters HSST3 C18柱、Phenomenex Luna C18柱和Unitary C18柱（规格：250 mm×4.6 mm，5 μm）；SB3200DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份公司）；XP205型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 选用Waters HSST3 C18色谱柱（250 mm×4.6mm，5 μm），柱温为30 ℃；检测波长分别为203 nm（0～20 min测定人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd）[12-16]、254 nm（20～34 min测定3′-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素）[17-19]、330 nm（34～75 min测定毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、苍术素醇、白术内酯Ⅱ、苍术素）[20-25]；流动相选用乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脱（0～10 min，13.0%乙腈；10～20 min，13.0%→26.0%乙腈；20～34 min，26.0%→45.0%乙腈；34～48 min，45.0%→52.0%乙腈；48～67 min，52.0%→68.0%乙腈；67～75 min，68.0%→13.0%乙腈），流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、3′-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、苍术素醇、白术内酯Ⅱ和苍术素对照品适量，用50%甲醇制成混合对照品贮备液，每1 mL 含上述11 种成分依次为0.712、1.198、0.814、1.970、6.372、1.516、0.430、0.172、0.118、0.294、0.538 mg。再将贮备液用50%甲醇稀释20倍制得混合对照品溶液（人参皂苷Rb1为35.6 μg/mL，人参皂苷Rb3为59.9 μg/mL，人参皂苷Rd为40.7 μg/mL，3′-羟基葛根素为98.5 μg/mL，葛根素为318.6 μg/mL，3'-甲氧基葛根素为75.8 μg/mL，毛蕊花糖苷为21.5 μg/mL，焦地黄苯乙醇苷B1为8.6 μg/mL，苍术素醇为5.9 μg/mL，白术内酯Ⅱ为14.7 μg/mL，苍术素为26.9 μg/mL）。

2.3 供试品溶液的制备 取津力达颗粒适量，研细，取细粉约3 g，精密称定于25 mL量瓶中，加50%甲醇20 mL，超声提取30 min，放至室温，用50%甲醇定容，摇匀，滤过，续滤液作为津力达颗粒供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备 取按津力达颗粒质量标准项下处方和制法制备的缺葛根，缺生地黄，缺苍术，缺人参、黄精、麦冬的4种阴性供试品各适量，按上述方法依次制得相应的阴性对照溶液。

2.5 专属性试验 取“2.2”项下混合对照品溶液、“2.3”项下供试品溶液及“2.4”项下阴性对照溶液，在“2.1”项下色谱条件下进样，记录色谱图。（见图1）结果显示津力达颗粒供试品溶液中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、3′-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、苍术素醇、白术内酯Ⅱ和苍术素与相邻色谱峰的分离度均≥1.5；理论板数按葛根素色谱峰计≥5 500；阴性对照不干扰各成分检测。

2.6 线性关系的考察 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品贮备液适量，用50%甲醇分别稀释4、10、20、40、100和200倍，摇匀制得6个混合对照品溶液（序号依次为1～6），依照“2.1”项下色谱条件进样，以所测人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、3′-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、苍术素醇、白术内酯Ⅱ和苍术素的质量浓度（X）对峰面积（Y）进行线性回归。（见表1）

表1 津力达颗粒中11 种成分的线性关系考察结果

2.7 精密度试验 在“2.1”项下色谱条件下，取津力达颗粒供试品溶液连续进样6次，得人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、3′-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、苍术素醇、白术内酯Ⅱ和苍术素峰面积的RSD值依次为1.25%、1.16%、1.19%、1.03%、0.54%、1.10%、1.36%、1.49%、1.51%、1.38%和1.32%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取津力达颗粒同一份供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下于制备后0、2、5、9、15、24 h进样分析，得人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、3′-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、苍术素醇、白术内酯Ⅱ和苍术素峰面积的RSD值依次为1.23%、1.19%、1.22%、0.99%、0.56%、1.08%、1.39%、1.52%、1.49%、1.36%和1.28%，表明津力达颗粒供试品溶液24 h内稳定。

2.9 重复性试验 取津力达颗粒适量，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液6份，再在“2.1”项下色谱条件下进样检测分析，并计算含量，得人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、3′-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、苍术素醇、白术内酯Ⅱ和苍术素含量的RSD值依次为1.64%、1.41%、1.50%、1.27%、0.96%、1.38%、1.73%、1.80%、1.91%、1.78%和1.85%，表明建立的方法重复性良好。2.10 加样回收率试验 取已知待测成分含量的津力达颗粒适量，研细，取细粉9份，每份1.5 g，精密称定后均分成3组，精密加入混合对照品溶液（人参皂苷Rb1为0.549 mg/mL，人参皂苷Rb3为0.872 mg/mL，人参皂苷Rd0.636 mg/mL，3′-羟基葛根素1.372 mg/mL，葛根素4.795 mg/mL，3'-甲氧基葛根素1.131 mg/mL，毛蕊花糖苷0.289 mg/mL，焦地黄苯乙醇苷B1为0.124 mg/mL，苍术素醇0.089 mg/mL，白术内酯Ⅱ0.212 mg/mL，苍术素0.407 mg/mL）0.8、1.0和1.2 mL，再按“2.3”项方法制成加样供试品溶液。在上述色谱条件下检测，得以上11种成分的平均加样回收率分别为98.96%、99.68%、98.03%、100.02%、100.12%、99.06%、96.77%、96.96%、97.90%、97.66%和98.76%，RSD分别为1.08%、1.28%、1.56%、0.67%、0.74%、1.30%、0.82%、1.21%、1.41%、1.18%和0.72%。2.11 相对校正因子（f）的计算 在上述色谱条件下进样“2.5”项下6个混合对照品溶液，用对照品质量浓度与峰面积之比计算各成分f，即fk/s=fk/fs=（Wk/Ak）/（Ws/As）=（Wk×As）/（Ws×Ak）。其中f、W和A依次代表RCF、质量浓度和峰面积，下标k和s分别代表内参物和其他待测成分。以葛根素为内参物，分别计算其他10种成分的f。（见表2）2.12 仪器及色谱柱对f的影响 分别选用仪器（UltiMate 3000型高效液相色谱仪和Perkin Elmer Series 200型高效液相色谱仪）和色谱柱（Waters HSST3 C18柱、Phenomenex Luna C18柱和Unitary C18柱），在上述色谱条件下进样“2.2”项下混合对照品溶液。结果测得各成分f的RSD在1.04%～1.93%之间，表明仪器与色谱柱对所建立的f无显著影响。（见表3）2.13 流速对f的影响 分别选用不同实验流速（0.8、1.0、1.2 mL/min），在上述色谱条件下进样“2.2”项下混合对照品溶液。结果测得各成分f的RSD在0.86%～1.91%之间，表明流速对所建立的f无显著影响。（见表4）2.14 柱温对f的影响 分别选用不同实验柱温（25、30、35 ℃），在上述色谱条件下进样“2.2”项下混合对照品溶液。结果测得各成分f的RSD在0.76%～1.94%之间，表明柱温对所建立的f无明显影响。（见表5）2.15 色谱峰定位 在上述色谱条件下进样“2.2”项下混合对照品溶液，采用相对保留时间值法对待测成分色谱峰进行定位，考察仪器（UltiMate 3000型高效液相色谱仪和Perkin Elmer Series 200型高效液相色谱仪）和色谱柱（Waters HSST3 C18柱、Phenomenex Luna C18柱和Unitary C18柱）对相对保留时间值（t）的影响。结果测得人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、3′-羟基葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、苍术素醇、白术内酯Ⅱ、苍术素与葛根素相对保留时间值（t）的RSD在0.81%～1.83%之间，表明目标化合物色谱峰的准确定位可采用相对保留时间值法。（见表6）2.16 含量测定 取15批津力达颗粒（编号：S1～S15），依“2.3”项下方法制备津力达颗粒供试品溶液，再按照“2.1”项下方法进样分析，分别运用外标法（ESM）和一测多评（QAMS）法计算津力达颗粒中各成分的含量，并采用t检验比较两种方法所得结果，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表7）

表2 津力达颗粒中各成分的f

表3 不同仪器及色谱柱对f的影响

表4 不同流速对f的影响

表5 不同柱温对f 的影响

表6 仪器及色谱柱对t 的影响

表7 津力达颗粒中11 种成分含量测定结果（mg/g，n=3）

3 化学计量学方法分析津力达颗粒质量

3.1 聚类分析 采用组间联接法，测度为欧氏距离，运用SPSS 26.0软件对15批津力达颗粒含量数据进行聚类分析。结果显示，15批津力达颗粒供试品聚为3类，S1、S3、S2、S4聚为第Ⅰ类，S9、S10、S6、S7、S8、S5 聚为第Ⅱ类，S11、S15、S12、S14、S13聚为第Ⅲ类。（见图2）

3.2 主成分分析 将表7中QAMS法所测得11种成分含量数据导入SPSS 26.0统计软件及微生信在线作图系统（www.bioinformatics.com.cn），进行主成分分析。表8显示前3个主成分特征值为7.303、1.168、1.074（均＞1），对方差的贡献率分别为66.389%、10.616%、9.760%，累计方差贡献率为86.765%（＞85%），表明前3个主成分即可代表津力达颗粒86.765%的质量信息。表9显示人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、3′-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1和苍术素对第一主成分的贡献度较大；白术内酯Ⅱ在第二主成分有明显正负荷值；苍术素醇对第三主成分影响较大。图3显示15批津力达颗粒聚为3类，S1～S4聚为第Ⅰ类，S5～S10聚为第Ⅱ类，S11～S15聚为第Ⅲ类，与聚类分析结果一致。

表8 主成分特征值和贡献率

表9 成分矩阵表

4 讨 论

4.1 指标性成分及内参物的选择 津力达颗粒由人参、黄精、麦冬、葛根、生地黄、炒苍术、苦参、制何首乌等17味中药材加工而成。方中人参补气固脱，补脾益肺，生津养血，为其君药；炒苍术燥湿健脾，黄精补气养阴、健脾益肾，苦参清热燥湿，三药合用，养脾阴、化脾湿、泻脾热、运脾气，共为臣药；生地黄、麦冬养阴生津，制何首乌补肝肾、益精血，山茱萸补肾涩精，茯苓渗湿健脾，佩兰芳香醒脾，黄连、知母清热泻火、滋阴润燥，炙淫羊藿扶肾阳、温脾土，丹参祛瘀生新、调经顺脉，地骨皮凉血除蒸，合为佐药；葛根生津止渴、升阳通经、引经上升，荔枝核行气散结、调畅气机，使益气滋阴之药直达病所，为使药。诸药共奏益气养阴、健脾运津之效。人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3和人参皂苷Rd等皂苷类成分为君药人参主要药效成分，同时臣药黄精、佐药麦冬亦含人参皂苷Rb1等皂苷类成分。现代药理研究表明人参皂苷Rb1可通过JNK信号通路改善糖尿病大鼠肝损伤及糖脂代谢异常，降低炎症反应[26]；人参皂苷Rb3可以明显抑制HepG2细胞肝糖异生途径关键转录因子FOXO1和HNF4α蛋白表达，从而抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的酶活性及糖异生作用，以达到降低血糖的目的[27]。苍术素醇、白术内酯Ⅱ和苍术素等为臣药炒苍术的主要活性成分。现代研究表明苍术具有显著的降糖增效作用[28]。毛蕊花糖苷和焦地黄苯乙醇苷B1为佐药地黄的特征成分。现代药理研究表明毛蕊花糖苷可能通过下调锌指转录因子1的表达，抑制机体的过度免疫应激从而抑制上皮细胞-间质转化，从而延缓糖尿病肾脏功能恶化[29]。3′-羟基葛根素、葛根素和3'-甲氧基葛根素等为佐药粉葛代表性成分。现代药理研究表明葛根素通过激活GLP-1R/Wnt/mTOR信号通路，改善海马神经可塑性，从而改善高脂诱导的糖尿病小鼠抑郁症状[30]。故本研究参考中药质量标志物选取原则，以君药人参所含成分为首选，同时兼顾臣药黄精和炒苍术，佐药麦冬和生地黄，以及使药葛根所含上述11种成分为定量控制目标成分，同时选取质量稳定、价格较低、含量较高且出峰时间适中的葛根素为内参物。

4.2 流动相的选择 本研究首先比较了乙腈-水、甲醇-水对津力达颗粒供试品检测的影响。结果表明，发现甲醇-水系统检测时，基线严重漂移，目标成分不能正常积分，且检测用时较长；乙腈-水系统检测时，色谱峰葛根素峰出现拖尾现象，与3'-甲氧基葛根素峰不能分离，通过调节柱温、流速、更换色谱柱等条件均不能改善此现象，考虑流动相中加入酸类溶液以改善峰形，进而对乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%甲酸流动相体系进行考察。发现使用乙腈-0.2%磷酸流动相时，各成分可以获得更好的响应值与分离度，且基线相对平稳，故选用乙腈-0.2%磷酸为流动相。

4.3 提取溶剂与方式的选择 津力达颗粒组方复杂，所含成分繁多。为较全面反映所含化学成分信息，本试验在供试品溶液制备时，以甲醇和乙醇为溶剂，采用操作简便的振荡提取，依法进样检测提取样品。结果显示，以甲醇为溶剂时，指标成分提取效果较好。故本试验考察了振荡、超声和加热回流，不同的提取时间（30、40、50、60 min），同时摸索了甲醇溶液的浓度（25%、50%、80%、100%）。结果显示，以50%甲醇超声提取30 min为供试品溶液制备方法时，指标成分综合提取效果最佳，杂质干扰较小。

4.4 含量测定结果及化学计量学评价分析 15批津力达颗粒所含人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、3′-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、苍术素醇、白术内酯Ⅱ和苍术素含量存在一定的批间差异，尤其是葛根素、苍术素醇、人参皂苷Rb1等成分较为显著，表明建立津力达颗粒多指标成分质控模式对稳定该制剂产品质量具有重要意义；同时高效液相一测多评法与外标法所得含量结果无明显差异（P＞0.05），表明本研究所建立的HPLC-QAMS法结果可靠，可用于津力达颗粒中11种成分含量的同时测定；聚类分析和主成分分析结果显示，15批津力达颗粒聚为3类，聚类结果与产品生产期间存在一定的关联性，有助于药品生产企业不断完善原药材种属来源、产地初加工等直接影响产品质量的源头控制，以及生产过程质量控制，为稳定该制剂产品质量提供了参考依据。

本研究采用HPLC-QAMS法同时测定了津力达颗粒中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、3′-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、苍术素醇、白术内酯Ⅱ和苍术素含量，建立了津力达颗粒多指标成分质控方法，同时对15批次样品进行了含量测定。所建立的方法操作便捷、数据结果准确。同时本研究采用聚类分析和主成分分析等化学计量学方法对检测结果进行了评价分析，可为进一步提升津力达颗粒质控水平，优化产品质量，确保临床用药疗效一致性及合理指导临床用药提供支持。