异钩藤碱对缺血性脑卒中模型大鼠脑损伤及神经元自噬的影响*

成家宏，孟毅，乔明亮

（河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450002）

脑卒中是继心脏病和癌症之后的第三大死亡原因[1]，其中缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）占所有脑卒中病例的85%以上。目前IS有效疗法为组织纤溶酶原激活剂和血管内血栓切除术[2]，但因缺血半暗带（ischemic penumbra，IP）时间窗和继发性缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤，患者可接受率较低[3]。在IS引起的缺血、缺氧和营养缺乏等应激条件下，IP神经元的自噬过程被激活。研究认为，自噬对IP神经元存活至关重要[4]，提示自噬可能是治疗IS的重要靶点。IS神经元损伤与氧供需失衡有关。缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）是IS缺氧的关键反应物之一，mTOR是调节自噬经典信号通路的关键因子。研究发现，缺氧状态下，HIF-1α可负调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）并诱导自噬[5]。异钩藤碱（isorhynchophylline，IRN）是一种从钩藤中提取的四环羟吲哚生物碱，具有抗炎、抗凋亡、抗神经毒性、调节自噬等作用[6]。但目前关于IRN对脑损伤尤其是对IS脑损伤的影响及可能作用机制方面的报道较少，故本实验拟利用线栓法致大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）以构建IS模型，并以依达拉奉作为阳性对照，探讨IRN对IS模型大鼠I/R脑损伤和神经元自噬的影响，分析其可能作用机制是否与HIF1α/mTOR通路有关，以期为IRN临床应用及IS临床治疗提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄SPF级雄性Wistar大鼠75只，体质量（200±20）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0013。实验前大鼠于24 ℃恒温、50%恒湿环境下，适应性饲养1周，12 h光-暗交替，自由获得饮水、饲料。本研究动物处置符合“3R”原则，经河南省中医院动物伦理委员会批准，伦理批号：HNZY-2020078。

1.2 药品与试剂 IRN（纯度≥98%，批号：6859-01-4）购自成都仪睿生物科技有限公司；依达拉奉（纯度≥99%，批号：89-25-8）购自美国Sigma公司；TTC染色试剂盒（批号：298-96-4）购自北京索莱宝生物科技有限公司；兔抗微管相关蛋白1轻链3B（microtubule associated protein 1 light chain 3B，LC3B）（批号：ab63817）、HIF-1α单克隆抗体（批号：ab179483）、mTOR单克隆抗体（批号：ab134903）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）单克隆抗体（批号：ab137133）、自噬相关蛋白Beclin1单克隆抗体（批号：ab207612）、自噬降解底物P62蛋白（autophagy degradation substrate p62 protein，p62）单克隆抗体（批号：ab91526）均购自美国Abcam公司。

1.3 主要仪器 Oxylab LDF型激光多普勒血流仪（北京拜安吉科技有限公司）；PerkinElmer EnVision型多功能酶标仪（美国PerkinElmer公司）。

1.4 分组与给药 75只大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、IRN低剂量组、IRN高剂量组、依达拉奉组，每组15只。其中IRN低剂量组、IRN高剂量组大鼠腹腔注射给药剂量分别为20、40 mg/（kg·d）[7]；依达拉奉组大鼠腹腔注射给药剂量为3 mg/（kg·d）[8]；假手术组及模型组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，1次/d，连续7 d。

1.5 IS大鼠模型构建 末次给药后，禁食不禁水12 h，除假手术组外，其他各组利用腔内MCAO诱导制备IS模型大鼠[9]，具体操作：腹腔注射水合氯醛（0.4 g/kg）麻醉大鼠，将其放于温控加热垫上操作以保持正常体温。颈部中线切口，分离右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，将一根带硅胶珠尖端的4/0单丝尼龙经颈外动脉插入右侧颈内动脉，阻断右侧大脑中动脉血液供应，激光多普勒血流仪监测右侧大脑中动脉的血流量，见血流量下降并低于基线30%即成功缺血，缺血2 h后撤回单丝进行血液再灌注。假手术组大鼠未中断血液供应，其他手术操作同上。

1.6 观察指标

1.6.1 神经功能缺损评分 血液再灌注24 h后，由实验不知情研究人员评估各组大鼠神经功能缺损评分[10]：正常，对称运动，无任何异常体征计0分；提尾时对侧前肢屈曲计1分；大鼠步态不稳，向脑损伤一侧转圈计2分；无法支撑身体而右侧躺卧计3分；意识水平降低，无自发性活动计4分；死亡计5分。

1.6.2 TTC染色测定脑梗死面积 麻醉大鼠并脱颈处死，取7只大鼠脑组织并称重（湿质量），作2 mm冠状冷冻切片，于37 ℃的2% TTC染液中孵育30 min，4%多聚甲醛4 ℃固定6 h。正常组织区域为红色，缺血梗死区因无线粒体酶活性而呈白色。采用Image J图像分析软件计算脑梗死面积，梗死面积百分比=白色面积/总面积×100%。

1.6.3 脑组织水含量测定 TTC染色后的脑切片于110 ℃干燥48 h，称重（干质量）。脑组织水含量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

1.6.4 HE染色检测大鼠脑组织病理变化 取剩余8只大鼠部分脑组织，常规石蜡包埋制备5 μm厚度脑切片。二甲苯脱蜡，乙醇脱水，苏木精染色2 min，伊红染色1 min，常规脱水，透明，中性树脂封片。400倍镜下观察并记录各组大鼠脑组织切片病理情况。神经元细胞核呈蓝色，细胞质呈不同程度的红色。

1.6.5 TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡 按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书，取上述石蜡切片，加入生物素标记液37 ℃反应1 h，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗3次，加入Streptavidin-HRP工作液室温孵育30 min，PBS洗3次，DAB显色，脱水透明，封片观察。400倍镜下，随机选取5个视野，计数TUNEL阳性细胞，阳性凋亡细胞核或细胞质在显微镜下呈褐色。凋亡指数（%）=凋亡阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.6.6 Western blotting法检测HIF-1α/mTOR通路相关因子蛋白表达 分离的缺血侧脑组织加入适量裂解液，匀浆裂解，后经4 ℃12 000 r/min离心10 min，取上清，测定蛋白浓度后加热变性，保存于-80 ℃备用。各组蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（压缩胶60 V 25 min，分离胶120V 70min），后转移至PVDF膜上（转膜条件200mA 120min），PVDF膜于5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，后于一抗内（HIF-1α、Beclin1均以1∶1 000稀释；mTOR、p62均以1:8 000稀释；p-mTOR以1∶5 000稀释；LC3B以1∶2 000稀释）4 ℃孵育过夜。次日洗膜，后于辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗（以1∶8 000稀释）内室温孵育1 h，TBST洗膜3～6次后，ECL显影，化学发光凝胶成像系统曝光并拍照记录。利用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白HIF-1α、mTOR、p-mTOR、LC3 Ⅱ、LC3 Ⅰ、Beclin1、p62与内参GAPDH灰度值比值表示蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法 使用SPSS 26.0软件分析数据，计量资料以“均数±标准差”（）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 与模型组比较，IRN低剂量组、IRN高剂量组及依达拉奉组大鼠神经功能缺损评分均明显降低（P＜0.05）；与IRN低剂量组比较，IRN高剂量组及依达拉奉组大鼠神经功能缺损评分均明显降低（P＜0.05）；与IRN高剂量组比较，依达拉奉组大鼠神经功能缺损评分明显降低（P＜0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（）

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与IRN低剂量组比较，bP＜0.05；与IRN高剂量组比较，cP＜0.05

2.2 各组大鼠脑梗死情况比较 假手术组大鼠脑组织呈红色均染，未见梗死；模型组、IRN低剂量组、IRN高剂量组及依达拉奉组大鼠脑组织可见明显梗死灶。与模型组比较，IRN低剂量组、IRN高剂量组及依达拉奉组大鼠脑梗死面积百分比均明显减小（P＜0.05）；与IRN低剂量组比较，IRN高剂量组及依达拉奉组大鼠脑梗死面积百分比均明显减小（P＜0.05）；与IRN高剂量组比较，依达拉奉组大鼠脑梗死面积百分比明显减小（P＜0.05）。（见图1、表2）

表2 各组大鼠脑梗死情况比较（）

表2 各组大鼠脑梗死情况比较（）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与IRN低剂量组比较，bP＜0.05；与IRN高剂量组比较，cP＜0.05

2.3 各组大鼠脑组织水含量比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织水含量明显增多（P＜0.05）；与模型组比较，IRN低、高剂量组及依达拉奉组大鼠脑组织水含量均明显减少（P＜0.05）；与IRN低剂量组比较，IRN高剂量组及依达拉奉组大鼠脑组织水含量均明显减少（P＜0.05）；与IRN高剂量组比较，依达拉奉组大鼠脑组织水含量明显减少（P＜0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠脑组织水含量比较（）

表3 各组大鼠脑组织水含量比较（）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与IRN低剂量组比较，cP＜0.05；与IRN高剂量组比较，dP＜0.05

2.4 各组大鼠脑组织病理形态学观察 假手术组大鼠缺血侧脑皮质神经元排列紧密，结构完整，形状规则，核仁清晰，未见水肿及炎症细胞浸润；模型组大鼠神经元出现明显核仁固缩，排列散乱且有空泡，形状不规则；与模型组比较，IRN低剂量组、IRN高剂量组及依达拉奉组大鼠脑组织神经元固缩逐渐减轻，形态逐渐规则，排列逐渐紧密。（见图2）

2.5 各组大鼠脑组织细胞凋亡情况 假手术组大鼠脑组织神经元呈淡蓝色，排列有序，结构完整；模型组大鼠可见大量棕色凋亡细胞，细胞固缩，排列无序；与模型组比较，IRN低剂量组、IRN高剂量组及依达拉奉组大鼠脑组织阳性凋亡细胞逐渐减少，形态逐渐改善。与模型组比较，IRN低剂量组、IRN高剂量组及依达拉奉组凋亡指数均明显降低（P＜0.05）；与IRN低剂量组比较，IRN高剂量组、依达拉奉组凋亡指数均明显降低（P＜0.05）；与IRN高剂量组比较，依达拉奉组凋亡指数均明显降低（P＜0.05）。（见图3、表4）

表4 各组大鼠缺血侧脑皮质细胞凋亡指数比较（）

表4 各组大鼠缺血侧脑皮质细胞凋亡指数比较（）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与IRN低剂量组比较，bP＜0.05；与IRN高剂量组比较，cP＜0.05

2.6 各组大鼠脑组织HIF1α/mTOR通路相关因子蛋白表达情况 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，IRN低剂量组、IRN高剂量组及依达拉奉组大鼠脑组织中HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）；与IRN低剂量组比较，IRN高剂量组及依达拉奉组大鼠脑组织HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）；与IRN高剂量组比较，依达拉奉组大鼠脑组织HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）。5组大鼠脑组织mTOR蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表5、图4）

表5 各组大鼠脑组织HIF-1α、mTOR、p-mTOR、LC3、Beclin1、p62 蛋白相对表达量比较（）

表5 各组大鼠脑组织HIF-1α、mTOR、p-mTOR、LC3、Beclin1、p62 蛋白相对表达量比较（）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与IRN低剂量组比较，cP＜0.05；与IRN高剂量组比较，dP＜0.05

3 讨 论

IS发病机制复杂，大脑某一区域血液循环发生障碍时，可导致脑组织缺氧及葡萄糖供应不足，引起谷氨酸相关的兴奋性毒性、炎症、氧化应激和细胞凋亡等一系列病理反应，进而启动细胞死亡途径，影响神经行为功能[11]。

脑缺血的主要临床表现为局灶性脑缺血，如短暂或永久性MCAO，因与IS非常相似而常用于探讨IS实验模型动物研究[12]。本研究结果显示，经短暂闭塞大脑中动脉后再灌注，模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高，脑梗死面积百分比明显增大，脑组织水含量明显增多，神经元出现明显核仁固缩，排列散乱且有空泡，凋亡细胞指数明显升高，提示MCAO可致严重I/R损伤，成功构建IS模型大鼠。神经元形态异常及高死亡率为I/R损伤标志，脑组织水含量可评估脑水肿程度。脑水肿可导致颅内压升高，是IS治疗关键[13]。依达拉奉是一种抗氧化剂和氧自由基清除剂，具有抗炎、增加血流量、减少神经损伤及改善神经功能等作用，常用作治疗脑卒中[14]。有研究表明，IRN可减轻I/R损伤大鼠脑梗死程度，降低脑缺血侧神经元死亡率及脑含水量[15]。本研究结果显示，经低、高剂量IRN及依达拉奉治疗后，IS模型大鼠脑组织病理损伤情况明显改善，神经功能缺损评分及脑梗死程度均明显降低，脑组织水含量明显减少，凋亡细胞指数明显降低，提示IRN具有改善IS模型大鼠脑损伤的作用。

自噬在IS神经元死亡调控中起双重作用[16]。适度自噬可通过消除受损的组织及蛋白质来拯救受损细胞，而过度自噬可促进细胞内容物降解，导致细胞死亡，最终损伤组织器官。LC3为自噬体的特异性标志物；p62可以作为自噬通量的衡量标准，被认为与自噬降解呈负相关。自噬形成时，胞浆型LC3（LC3-Ⅰ）会酶解掉一小段多肽，转变为自噬体膜型（LC3-Ⅱ）。当LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平降低时，p62在细胞中积聚，自噬受阻，可导致自噬活性降低[17]。Beclin1是自噬的关键参与者，被认为参与调节自噬体合成与成熟[18]。研究发现，脑卒中恢复期神经元自噬水平较高[19]。本研究结果显示，模型组大鼠脑组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相对表达量明显升高，p62蛋白相对表达量明显降低，提示自噬发生和自噬活性较强；而经低、高剂量IRN及依达拉奉治疗后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1及p62表达情况发生逆转，提示IRN可抑制IS大鼠神经元自噬体形成，降低自噬活性。

IS缺血状态可诱导HIF-1转录，HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亚基组成的异源二聚体，其活性由HIF-1α决定。常氧条件下，HIF-1α被蛋白酶体降解；缺氧条件下，蛋白酶体可抑制HIF-1α降解，稳定HIF-1α与分子伴侣的结合进而增加HIF-1活性。研究发现，HIF-1α信号通路可以促进缺氧诱导的自噬[20]，自噬受mTOR信号通路负性调控，能量缺乏可导致mTOR活性失活从而导致自噬增加[21]。mTOR可通过调节HIF-1α影响凋亡与自噬，缺氧状态下HIF-1α可反向调节mTOR，HIF-1α过表达通常伴随mTOR途径的抑制[22]。本研究结果显示，模型组大鼠HIF-1α蛋白相对表达量明显升高，mTOR磷酸化水平明显降低，提示IS大鼠在脑卒中氧糖剥夺情况下，可出现HIF-1α响应及mTOR失活而促进自噬发生。经IRN低剂量组、IRN高剂量及依达拉奉治疗后，HIF-1α及mTOR磷酸化水平被逆转，提示HIF-1α降解和mTOR激活可促进IS模型大鼠脑组织损伤的恢复。

综上所述，IRN可通过减轻IS模型大鼠神经功能缺损及脑水肿，减少脑梗死并降低神经元凋亡水平，改善脑组织病理损伤，其作用机制可能与抑制HIF1α表达、激活mTOR信号进而抑制IS模型大鼠神经元过度自噬有关。