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菟丝子总黄酮对PCOS大鼠血清甲状腺激素、排卵障碍的影响及机制研究*

2022-11-08赵千影汪栋材吴海滨林基伟宋晓容

中医药导报 2022年5期
关键词:菟丝子批号卵泡

赵千影,汪栋材,吴海滨,林基伟,宋晓容

(深圳市中医院,广东 深圳 518000)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是临床常见的内分泌紊乱疾病,多发于育龄期及青春期女性[1]。流行病学调查显示,我国PCOS发病率为5%~10%,且呈上升趋势。PCOS可在早期影响患者生殖及内分泌系统,造成其不孕,后期则易诱发高胰岛素血症、子宫内膜癌、糖尿病、心脑血管疾病等并发症[2]。口服避孕药是目前临床治疗PCOS的首选方法,可调节月经周期、增加排卵,以恢复生育能力,但对部分患者效果并不理想,且易加重胰岛素抵抗[3]。菟丝子总黄酮是中药菟丝子的主要活性成分之一,具有抗癌、抗氧化、提升免疫力、保肝、调节生殖系统功能等多种药理活性[4]。有研究[5]表明,菟丝子总黄酮可增加卵巢质量及卵泡数量、提高雌激素水平、提升卵巢功能,从而对卵巢早衰大鼠产生治疗作用,但关于其对PCOS甲状腺功能的影响及排卵障碍的治疗作用研究尚少,且缺乏对应的机制研究。本研究通过建立PCOS大鼠模型,观察菟丝子总黄酮对PCOS大鼠的治疗作用,并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7周龄雌性SPF级SD大鼠45只,体质量(170±10)g,健康状况良好,购自北京科宇动物养殖中心,生产许可证号:SCXK(京)2018-0010。饲养于清洁、通风环境,温度23 ℃左右,湿度60%左右,明暗周期12 h/12 h循环。本研究过程中处理动物时均符合2006年中华人民共和国科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》,并经本院实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 菟丝子总黄酮(陕西昂威生物医药科技有限公司,批号:20090912);丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路激动剂表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)(北京华越洋生物科技有限公司,批号:62253-63-8);脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)(上海沪震实业有限公司,批号:DKO124);促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)放射免疫试剂盒(批号:E-EL-R0976c)、游离三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)放射免疫试剂盒(批号:E-EL-0079c)、游离甲状腺素(free thyroxine,FT4)放射免疫试剂盒(批号:E-EL-0122c)均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine,T3)放射免疫试剂盒(批号:SP12617)、甲状腺素(thyroxine,T4)放射免疫试剂盒(批号:SP12618)、促卵泡生长激素(follicle stimulating hormone,FSH)微粒子酶免疫试剂盒(批号:SP12603)、黄体生成激素(luteinizing hormone,LH)微粒子酶免疫试剂盒(批号:SP12626)、雌二醇(estradiol,E2)微粒子酶免疫试剂盒(批号:SP12610)均购自武汉赛培生物科技有限公司;空腹胰岛素(fasting serum lisulin,FINS)放射免疫试剂盒(中国台湾Abnova公司,批号:KA3811);兔抗大鼠p38 MAPK一抗(批号:ab221012)、兔抗大鼠p-p38 MAPK一抗(批号:ab284564)、兔抗大鼠ERK1/2一抗(批号:ab176640)、兔抗大鼠p-ERK1/2一抗(批号:ab126445)均购自美国Abcam公司。

1.3 主要仪器 CX33显微镜(日本奥林巴斯株式会社);AIA-1800全自动荧光磁微粒酶免疫分析仪(日本东曹株式会社);Gel SMART凝胶成像仪[大龙兴创实验仪器(北京)股份公司]。

1.4 造模与分组 35只大鼠建立PCOS模型。大鼠适应性饲养3 d后,颈背部皮下注射0.2 mL DHEA大豆油混合液(剂量:DHEA 60 mg/100 g体质量),1次/d,持续20 d,每日早上观察阴道涂片,若连续两个动情周期上皮细胞均未角化,则表明动情周期混乱,PCOS模型构建成功[6]。PCOS模型复制成功31只,采用随机数字表法分为PCOS组(11只)、干预组(10只)、联合组(10只);另取10只正常大鼠注射0.2 mL大豆油,其余方法相同,设为对照组。

1.5 实验给药 确认建模成功次日,联合组大鼠灌胃菟丝子总黄酮生理盐水悬浊液(200 mg/kg)[7],2 h后尾静脉注射EGF PBS溶液(10 μg/kg)[8];干预组大鼠灌胃菟丝子总黄酮生理盐水悬浊液(200 mg/kg),2 h后尾静脉注射等量PBS;对照组、PCOS组大鼠灌胃等体积生理盐水,2 h后尾静脉注射等量PBS,1次/d,持续21 d。

1.6 观察指标 末次干预后,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠,腹主动脉采血,4 ℃下3 000 r/min离心10 min(离心半径8 cm),将获取血清分成两份,4 ℃冰箱保存,分别用于甲状腺激素检测及血糖指标检测;采血后颈椎脱臼处死大鼠,开腹取其双侧卵巢,切取部分卵巢组织,一半固定于4%多聚甲醛24 h,脱水、透明、浸蜡、包埋,切为4 μm连续病理切片,用于HE染色,另一半投入液氮中保存,用于蛋白检测。

1.6.1 血清甲状腺激素水平 取4 ℃保存血清,采用放射免疫分析法检测血清TSH、FT3、FT4、T3、T4水平,根据试剂盒说明书设计实验步骤,计算血清TSH、FT3、FT4、T3、T4水平。

1.6.2 血清性激素水平 取4 ℃保存血清,采用微粒子酶免疫分析法及全自动荧光磁微粒酶免疫分析仪检测FSH、LH、E2水平。

1.6.3 血清FINS、HOMA-IR 取4 ℃保存血清,经血糖仪检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、放射免疫试剂盒检测FINS,计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment for insulin resistance,HOMA-IR)。HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.6.4 HE染色观察卵巢组织病理学改变及排卵情况 取卵巢组织切片,二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,移入苏木精溶液浸泡8 min,自来水冲洗,盐酸酒精分化液分化,自来水冲洗,促蓝液反蓝,移入伊红溶液染色2 min,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,滴加中性树脂封片,光镜下观察卵巢组织病理变化,记录排卵数、囊样扩张卵泡数。排卵率=有排卵大鼠数/该组大鼠数×100%。平均排卵数=黄体总数/该组大鼠数×100%。囊性扩张卵泡率=囊样扩张卵泡总数/该组大鼠数×100%。

1.6.5 Western blotting法检测卵巢组织p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量 取液氮中保存的卵巢组织,剪碎并充分研磨,匀浆后加入RIPA液裂解细胞,移至离心管内,低温离心机9 000 r/min离心15 min(离心半径10 cm),经BCA试剂盒定量蛋白。取40 μg蛋白样本,以1∶4的体积比混合上样缓冲液,80 V电压下行凝胶电泳分离,湿法转至硝酸纤维素膜,5%脱脂牛奶封闭2 h,TBST清洗,混合工作浓度1∶500的兔抗大鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2一抗,4 ℃摇床孵育过夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000)混匀,室温孵育40 min,ECL发光,暗盒显影,采用凝胶成像分析仪分析蛋白条带灰度值,p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相对表达量分别为p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值。计算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2。

1.7 统计学方法 通过SPSS 23.0进行统计学分析,计量资料以()表示,多样本资料比较用单因素方差分析,以LSD-t行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清甲状腺激素指标比较 与对照组比较,PCOS组大鼠血清TSH水平明显升高(P<0.05),FT3、FT4、T3、T4水平均明显降低(P<0.05);与PCOS组比较,干预组大鼠血清TSH水平明显降低(P<0.05),FT3、FT4、T3、T4水平均明显升高(P<0.05);与干预组比较,联合组大鼠血清TSH水平明显升高(P<0.05),FT3、FT4、T3、T4水平均明显降低(P<0.05)。(见表1)

表1 各组大鼠血清甲状腺激素指标比较()

表1 各组大鼠血清甲状腺激素指标比较()

注:与对照组比较,aP<0.05;与PCOS组比较,bP<0.05;与干预组比较,cP<0.05

2.2 各组大鼠血清性激素水平比较 与对照组比较,PCOS组大鼠血清LH水平明显升高(P<0.05),FSH、E2水平均明显降低(P<0.05);与PCOS组比较,干预组大鼠血清LH水平明显降低(P<0.05),FSH、E2水平均明显升高(P<0.05);与干预组比较,联合组大鼠血清LH水平明显升高(P<0.05),FSH、E2水平均明显降低(P<0.05)。(见表2)

表2 各组大鼠血清性激素水平比较()

表2 各组大鼠血清性激素水平比较()

注:与对照组比较,aP<0.05;与PCOS组比较,bP<0.05;与干预组比较,cP<0.05

2.3 各组大鼠胰岛素抵抗指标比较 与对照组比较,PCOS组大鼠FINS、HOMA-IR水平均明显升高(P<0.05);与PCOS组比较,干预组大鼠FINS、HOMA-IR水平均明显降低(P<0.05);与干预组比较,联合组大鼠FINS、HOMA-IR水平均明显升高(P<0.05)。(见表3)

表3 各组大鼠胰岛素抵抗指标比较()

表3 各组大鼠胰岛素抵抗指标比较()

注:与对照组比较,aP<0.05;与PCOS组比较,bP<0.05;与干预组比较,cP<0.05

2.4 各组大鼠卵巢组织病理改变情况 对照组大鼠卵巢组织中可观察到处于不同发育阶段的卵泡,黄体数量较多,卵泡囊性扩张极少;PCOS组大鼠卵巢结构紊乱,可观察到较多卵泡囊性扩张,窦前卵泡、闭锁卵泡数量增加,发育期卵泡与黄体数量明显减少;与PCOS组比较,干预组、联合组大鼠卵巢结构有所改善,可观察到卵泡囊性扩张,以及一定数量的发育期卵泡及黄体,窦前卵泡、闭锁卵泡数量有所减少,其中干预组改善效果优于联合组。(见图1)

2.5 各组大鼠排卵情况比较 与对照组比较,PCOS组大鼠排卵率明显降低(P<0.05),平均排卵数明显减少(P<0.05),囊性扩张卵泡率明显升高(P<0.05);与PCOS组比较,干预组大鼠排卵率明显升高(P<0.05),平均排卵数明显增加(P<0.05),囊性扩张卵泡率明显降低(P<0.05);与干预组比较,联合组大鼠排卵率明显降低(P<0.05),平均排卵数明显减少(P<0.05),囊性扩张卵泡率升高(P<0.05)。(见表4)

表4 各组大鼠排卵情况比较()

表4 各组大鼠排卵情况比较()

注:与对照组比较,aP<0.05;与PCOS组比较,bP<0.05;与干预组比较,cP<0.05

2.6 各组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比较 与对照组比较,PCOS组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明显升高(P<0.05);与PCOS组比较,干预组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明显降低(P<0.05);与干预组比较,联合组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2明显升高(P<0.05)。(见表5、图2)

表5 各组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 比较()

表5 各组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 比较()

注:与对照组比较,aP<0.05;与PCOS组比较,bP<0.05;与干预组比较,cP<0.05

3 讨 论

PCOS是由下丘脑-垂体-卵巢轴代谢紊乱引起的非器质性疾病,临床表现为月经周期紊乱、排卵异常、胰岛素抵抗、高雄激素血症等,以双侧卵巢纤维化多囊性变,体积增大,膜下出现囊性扩张卵泡为主要病理改变[9]。肥胖、月经周期延长、缺乏运动、不良饮食习惯、母亲孕期健康不佳等均是PCOS的危险因素,目前其发病机制尚未被完全阐明,多认为与胰岛素抵抗、下丘脑内分泌失调、甲状腺功能异常、遗传及环境因素等相关,其中胰岛素抵抗机制被更多学者认可[10]。甲状腺激素可发挥胰岛素拮抗作用,其水平异常可影响促性腺激素活性,促使卵巢增大,加速PCOS发病,胰岛素抵抗加重可提升黄体生成素及雄激素水平,降低卵泡刺激素活性,从而减少排卵数量[11-12]。因此,寻找调节甲状腺激素同时降低胰岛素抵抗的新型治疗手段,对于PCOS治疗具有积极意义。

中医学将PCOS归于“月经不调”“闭经”“不孕”等范畴,认为“冲任起于胞宫,隶属肝肾”。本病主要病机为禀赋不足、后天失养、肾阳不足、肝气郁结、逆行犯脾,以致精血不足、血失流畅、任冲不通、天癸不至、胞宫虚寒、无血可下,子宫无法摄精成孕,终而发病。肾虚是其根本病因,故治疗应以补肾填精、活血化瘀为主[13]。中药菟丝子又称豆寄生,是临床常用补肾药材,取自双子叶寄生植物菟丝子干燥成熟种子,性平,味辛、甘,归肝经、肾经、脾经,可补肾、固精、止泻、明目。唐代名家甄权言其可治虚冷,填精益髓,去腰疼膝冷。现代中医著作《山东中药》记载,菟丝子可治妇人习惯性流产[14]。菟丝子总黄酮是菟丝子中黄酮类化合物的总称,作为一种植物雌激素,可在人体雌激素水平较低时表现类雌激素效应,在雌激素水平较高时表现抗雌激素效应,发挥其雌激素平衡作用[15]。有学者[16]认为,菟丝子总黄酮可修复子宫内双酚A诱导的小鼠后代卵巢功能障碍,提升促卵泡激素水平,促进排卵。本研究结果显示,与PCOS组比较,干预组大鼠血清TSH、LH、FINS、HOMA-IR水平及囊性扩张卵泡率明显降低,FT3、FT4、T3、T4、FSH、E2水平及排卵率明显升高,平均排卵数明显增加,提示菟丝子总黄酮可改善PCOS大鼠甲状腺激素及性激素水平,降低胰岛素抵抗,促进排卵。

MAPK/ERK通路是胞外至胞核信息传递的重要通路之一,广泛参与细胞增殖、迁移、分化等过程。p38 MAPK、ERK是该通路重要调节因子,均属于MAPK家族。细胞外刺激激活p38 MAPK后,磷酸化的p38 MAPK可进入细胞核,激活下游酶蛋白引发酶促反应,激活ERK1/2,p-ERK1/2激活下游相关基因转录,降低胰岛素受体底物活性,从而增加胰岛素抵抗[17-18]。YE H等[19]研究认为,抑制MAPK/ERK通路可改善PCOS大鼠卵巢形态,提升促卵泡激素水平,减轻胰岛素抵抗。本研究结果显示,与对照组比较,PCOS组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2均明显升高,干预组大鼠卵巢组织p-p38 MAPK/p38MAPK、-ERK1/2/ERK1/2均明显降低,且联合组大鼠血清TSH、LH、FINS、HOMA-IR水平、囊性扩张卵泡率升高,FT3、FT4、T3、T4、FSH、E2水平、排卵率均明显降低,平均排卵数减少,提示MAPK/ERK通路在PCOS中异常激活,菟丝子总黄酮可能通过调节该通路对PCOS产生治疗作用。

综上所述,菟丝子总黄酮可改善PCOS大鼠甲状腺激素及性激素水平,降低胰岛素抵抗,促进排卵。其作用机制可能与抑制MAPK/ERK通路有关。

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