针刺对腰椎后路减压融合内固定术大鼠的抑炎镇痛作用及Akt/NF-κB通路的影响*

杨文文，许兰，吴继新，王增亮

（新疆医科大学第六附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000）

腰椎后路融合减压内固定术是治疗腰椎疾病的常用方法，手术疗效佳，且相对安全，但手术创伤大，术后疼痛严重是该手术存在的最大弊端，因此如何减轻术后疼痛成为亟待解决的问题[1]。针刺疗法通过直接刺激神经根，经神经纤维传导作用激活下丘脑-垂体-肾上腺轴系统，从神经、体液和免疫三方面共同作用，抑制致痛因子释放，同时促进血液循环中致痛因子代谢[2]。炎症反应在神经病理性疼痛的产生和维持中发挥了重要作用。研究发现，香叶木素通过抑制炎症反应，可有效缓解椎间盘退变引起的神经根性疼痛[3]。葛根素可通过减轻炎症反应治疗腰椎间盘突出症大鼠的神经根疼痛[4]。蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/核因子κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）信号通路是调节炎症反应的重要信号因子，参与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素（interleukin，IL）等多种炎症因子的产生与释放[5]。但是针刺疗法能否通过Akt/NF-κB信号通路抑制炎症反应，从而缓解腰椎后路融合减压内固定术大鼠神经性疼痛需要进一步研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄健康SPF级雄性SD大鼠50只，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2017-0011。饲养环境：室温（25±1）℃，相对湿度40%～60%，12 h昼夜节律交替。该实验经新疆医科大学第六附属医院伦理委员会审批，审批号：XJYKD29018。

1.2 试剂 TNF-α试剂盒（批号：D731168-0048）、IL-6试剂盒（批号：DG94490Q-48T）、IL-1β试剂盒（批号：QS41588-48T）均购自上海碧云天生物科技有限公司；β-内啡肽（β-endorphin，β-EP）（深圳市益百顺科技有限公司，批号：JM-01642R2）；P物质（substance P，SP）（深圳市文乐生物科技有限公司，批号：EK7186）；5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）（北京奇松生物科技有限公司，批号：QS41983-48T）；氟比洛芬酯（北京泰德制药股份有限公司，批号：598905）；兔抗鼠Akt抗体（批号：ab8005）、p-Akt抗体（批号：ab38449）、NF-κB抗体（批号：ab220803）和p-NF-κB p65抗体（批号：ab239882）均购自美国Abcam公司。

1.3 主要仪器 GB2024-94型华佗牌无菌针具（苏州华佗医疗器械有限公司）；Synergy NEO2多功能酶标仪（美国Bio-TEK公司）；TS100倒置显微镜（北京派迪威仪器有限公司）；PL-200热刺痛仪（成都泰盟科技有限公司）；1658001电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 分组与造模 从50只SD大鼠中随机取10只作为对照组，其余40只大鼠建立腰椎间盘突出症模型[6]，具体操作如下：腹腔麻醉大鼠，在尾部距肛门1 cm处断尾，将尾椎关节椎间盘组织中的乳白色胶冻样髓核组织取出备用。大鼠背部消毒，纵向做一长约3 cm的切口，将L5～6从左侧棘突上钝性分离，暴露横突，切除左侧部分L5、L6段的椎板和上下关节突，将尾椎髓核组织植入左侧L5神经根硬膜囊的交界处，逐层缝合组织；对照组大鼠不植入尾椎髓核组织，其余操作同上。大鼠出现精神萎靡、活动减少，活动速度减慢，步幅和频率降低，热痛阈值降低则提示造模成功。3 d后，打开手术区，扩大椎板，充分暴露椎间隙，在左侧L5椎弓根植入一枚螺钉，移除突出椎间盘，植入椎间融合器，逐层缝合组织。将造模成功的36大鼠随机分为模型组（12只）、针刺组（12只）和氟比洛芬酯组（12只）。

1.5 干预措施 针刺组大鼠于术后2 h进行针刺“肾俞穴”，参照张露芬[7]的《实验针灸学》，大鼠麻醉后固定于鼠板上，于第二腰椎棘突下旁开7 mm位置，用华佗一次性针灸针（规格：0.22 mm×25 mm）刺入，深度为5 mm，针刺后连接电针仪，波形设为疏密波，频率为2 Hz，每次电针20 min，1次/d，连续5 d；对照组、模型组和氟比洛芬酯组大鼠不做针刺处理；氟比洛芬酯组大鼠于术后2 h，尾静脉注射氟比洛芬酯注射液，25 mg/kg，2次/d，两次时间间隔12 h，连续5 d；对照组、模型组和针刺组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。

1.6 观察指标

1.6.1 热板致痛实验测定各组大鼠痛阈值 末次干预结束2 h后，把各组大鼠置于热板上，维持热板的温度为（55.0±0.5）℃，观察各组大鼠在1 min内从接触热板到舔后足的时间，该时间则为大鼠的痛阈值。

1.6.2 ELISA法检测各组大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平及β-EP、5-HT和SP含量 痛阈值测定完成后，各组大鼠断颈处死，打开胸腔，收集主动脉血，室温静置沉淀30 min后，3 000 r/min离心10 min（离心半径8 cm），吸取上清液为待测样品。取出酶标包被的96孔板，加入稀释液，孵育30 min，加入待测样品，37 ℃孵育30 min，弃掉液体后，洗涤5次，加入酶标抗体，置于37 ℃水浴锅中孵育30 min，洗涤5次，加入底物液，37 ℃水浴锅孵育30 min，加入终止液反应15 min，酶标仪490 nm处测定吸光度（A）值。

1.6.3 HE染色检测L5神经根组织病理学改变 血液采集完成后，打开腹腔，剥离L5神经根，截取约2 mm，置于4%多聚甲醛中固定，经脱水、石蜡包埋后，切成厚度为4 μm的石蜡切片，进行HE染色。

1.6.4 Western blotting法检测p-Akt、Akt、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白相对表达量 取L5～6背根神经节，液氮中研磨，裂解液裂解，12 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），收集上清液，12% SDS-PAGE凝胶电泳，120 V电泳2 h，0.3 A湿转2 h，TBST洗膜，封闭1 h，p-Akt、Akt、p-NF-κB、NF-κB和GAPDH一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL显色，Image J分析条带灰度值，目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值即为目的蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件处理数据，符合正态分布的计量资料以“均数±标准差”（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠痛阈值比较 模型组大鼠痛阈值明显低于对照组（P＜0.05）；针刺组和氟比洛芬酯组大鼠痛阈值明显高于模型组（P＜0.05）；氟比洛芬酯组大鼠痛阈值明显高于针刺组（P＜0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠痛阈值比较（）

表1 各组大鼠痛阈值比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与针刺组比较，cP＜0.05

2.2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平比较 模型组大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明显高于对照组（P＜0.05）；针刺组和氟比洛芬酯组大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明显低于模型组（P＜0.05）；氟比洛芬酯组大鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明显低于针刺组（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平比较（，ng/mL）

表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平比较（，ng/mL）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与针刺组比较，cP＜0.05

2.3 各组大鼠血清中β-EP、SP和5-HT含量比较 模型组大鼠血清中β-EP含量明显低于对照组（P＜0.05），SP和5-HT含量均明显高于对照组（P＜0.05）；针刺组和氟比洛芬酯组大鼠血清中β-EP含量明显高于模型组（P＜0.05），SP和5-HT含量均明显低于模型组（P＜0.05）；氟比洛芬酯组大鼠血清中β-EP含量明显高于针刺组（P＜0.05），SP和5-HT含量均明显低于针刺组（P＜0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠血清中β-EP、5-HT 和SP 含量比较（）

表3 各组大鼠血清中β-EP、5-HT 和SP 含量比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与针刺组比较，cP＜0.05

2.4 各组大鼠L5神经根病理学改变情况 对照组大鼠神经细胞结构完整、形态正常、排列整齐，未见炎症细胞浸润；模型组大鼠神经细胞排列紊乱、细胞边界模糊，明显水肿，髓鞘发生崩解，排列不整齐，有大量炎症细胞浸润；针刺组和氟比洛芬酯组大鼠神经细胞排列稍整齐，炎症细胞浸润减少，细胞轻度水肿。（见图1）

2.5 各组大鼠背根神经节p-Akt、Akt、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白相对表达量比较 4组大鼠背根神经节Akt和NF-κB p65蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。模型组大鼠背根神经节p-Akt和p-NF-κB p65蛋白相对表达量均明显高于对照组（P＜0.05）；针刺组和氟比洛芬酯组大鼠背根神经节p-Akt和p-NF-κB p65蛋白相对表达量均明显低于模型组（P＜0.05）；氟比洛芬酯组大鼠背根神经节p-Akt和p-NF-κB p65蛋白相对表达量均明显低于针刺组（P＜0.05）。（见表4、图2）

表4 各组大鼠背根神经节p-Akt 和p-NF-κB 蛋白相对表达量比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与针刺组比较，cP＜0.05

3 讨 论

腰椎间盘退行性疾病常见于中老年人群，但随着生活方式的改变，该类疾病发病人群逐渐趋于年轻化。腰椎间盘突出、腰椎滑脱以及腰椎管狭窄等都是临床上常见的腰椎疾病。目前对于该类疾病常采用手术治疗，钉棒系统内固定是最常用的治疗方法，不仅能使病变锥体在手术后获得持久性的稳定，而且还能保持手术区域锥体间的间距，从而使椎管维持正常形态。但由于该手术造成的创伤大，术后疼痛严重，因此限制了其临床应用[7]。而针刺疗法能有效缓解疼痛，如WANG Y等[8]研究表明针刺联合神经阻滞可提高Ⅰ级腰椎滑脱治疗的有效率，减轻患者疼痛，恢复脊柱功能，提高患者生活质量。BUEVICH V等[9]研究表明针刺治疗可有效减轻闭锁性椎间盘突出症患者疼痛程度。因此，本研究探讨针刺疗法缓解腰椎后路减压融合内固定术后大鼠疼痛的作用及可能机制。

肾俞穴来源于《灵枢·背俞》，是治疗腰背痛的常用穴位，属于足太阳膀胱经的经穴。膀胱经统领体表阳气，循行经腰部及下肢后侧，具有舒筋健骨、壮腰补肾之功。《针灸甲乙经》记载“肾俞，在第十四锥三分，留七呼，灸三壮”，意为肾俞位于第二腰椎棘突下旁开1.5寸。研究发现，针刺肾俞穴可有效缓解腰椎间盘突出症大鼠神经痛[10]。氟比洛芬酯是临床上常用的非甾体类抗炎镇痛药，具有良好的镇痛效果，因此本研究用氟比洛芬酯作为阳性对照药物。当外界刺激达到刚好使大鼠出现痛觉时，这一临界值则为大鼠的痛阈。当大鼠感受到痛觉时，则会做出生理性痛反应，常表现为一种屈肌反射。本研究通过将大鼠置于热板上，记录大鼠做出屈肌反射的时间，以此判断大鼠对疼痛的敏感程度。结果显示与对照组比较，模型组大鼠痛阈值降低，而与模型组比较，针刺组和氟比洛芬酯组大鼠痛阈值升高。提示腰椎后路减压融合内固定术后大鼠对疼痛的敏感程度增强，针刺和氟比洛芬酯治疗后大鼠对疼痛的敏感程度降低。研究发现，炎症反应是导致腰腿痛的主要原因，炎症因子的大量产生导致神经根损伤，从而引起腰腿痛。研究表明，氯胺酮能通过抑制神经根炎症反应，缓解腰椎间盘突出大鼠疼痛和椎间盘退变[11]。补阳还五汤能抑制炎症因子产生，减轻腰椎管狭窄患者术后疼痛[12]。临床研究表明，健腰利筋汤联合牵引复位能有效缓解腰椎间盘突出症患者疼痛和腰部功能障碍，减轻病变部位的炎症反应[13]。因此，本研究检测了大鼠血清炎症因子含量，结果显示模型组大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量明显高于对照组，针刺组和氟比洛芬酯组大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量明显低于模型组。提示针刺可降低腰椎后路减压融合内固定术后大鼠炎症反应。

SP作为一种兴奋性递质，能起到传递疼痛信息的作用，是痛觉传导的重要参与者。SP主要分布于中枢及外周神经系统，能通过刺激巨噬细胞、肥大细胞等释放促炎因子，将痛觉信号传递到大脑，从而产生痛觉。此外，P物质可引起组织水肿，造成局部大量氢离子聚集，从而使感受器细胞膜产生动作电位，将疼痛信号传递至中枢系统[14]。临床研究证明，内热针可有效缓解膝关节半月板缝合术后遗留的疼痛，而且能降低患者血清中P物质浓度[15]。在中枢神经系统中，5-HT分布于下丘脑、松果仁等部位，是一种单胺类活性物质。外周血中高浓度5-HT可引起神经末梢受体激活，从而产生强烈的疼痛，同时5-HT能通过负反馈调节可促进SPP释放[16]。β-EP是一种能够调节痛觉的阿片肽类抑制性神经肽，分布于下丘脑、垂体和肾上腺等部位，不仅具有镇痛效应，同时还可调节体温、炎症反应和内分泌等。正常状况下，β-EP不具有活性，在血浆中仅少量存在，当机体受到疼痛刺激时，垂体大量释放β-EP，可抑制SP释放，同时抑制感觉神经元传递痛觉。此外，机体受到伤害时，β-EP激活参与调节激素水平，发挥免疫抑制作用，降低炎症反应，从而发挥镇痛作用[17]。本实验中模型组大鼠血浆中5-HT和SP含量明显高于对照组，而β-EP含量明显低于对照组，针刺组和氟比洛芬酯组大鼠血浆中5-HT和SP含量明显低于模型组，而β-EP含量明显高于模型组。结果提示：针刺可降低致痛物质产生，同时促进镇痛物质产生。炎症因子大量释放，常损伤神经根，引起疼痛。本研究HE染色检测L5神经根结果显示：对照组大鼠神经细胞结构完整、形态正常、排列整齐，未见炎症细胞浸润；模型组大鼠神经细胞排列紊乱、细胞边界模糊，明显水肿，髓鞘发生崩解，排列不整齐，有大量炎症细胞浸润；针刺组和氟比洛芬酯组大鼠神经细胞排列稍整齐，炎症细胞浸润减少，细胞轻度水肿。结果提示：针刺可改善腰椎后路减压融合内固定术后大鼠腰椎神经损伤。

Akt/NF-κB信号通路在调节炎症反应过程中发挥重要作用，LING D Y等[18]研究表明吗啡能通过PI3K-Akt-NF-κB通路抑制炎症微环境对慢性胫骨癌痛的促进作用。HE W等[19]研究表明穿心莲内酯可通过调节Notch1/Akt/NF-κB轴对结核分枝杆菌感染的巨噬细胞产生抗炎作用。因此本研究通过蛋白印迹法检测Akt/NF-κB信号通路相关蛋白表达，结果表明模型组大鼠背根神经节p-Akt和p-NF-κB p65蛋白相对表达量明显升高，而针刺组和氟比洛芬酯组大鼠背根神经节p-Akt和p-NF-κB p65蛋白相对表达量明显降低。提示针刺可抑制Akt/NF-κB信号通路激活。

综上所述，针刺可抑制腰椎后路减压融合内固定术后炎症反应，缓解疼痛，其可能是通过抑制Akt/NF-κB信号通路发挥作用。本研究结果可为针刺缓解腰椎间盘突出、腰椎管狭窄等腰椎疾病术后疼痛提供理论依据。