大麻遗传标记的法医学应用研究进展

夏若成，陶瑞旸，林 源，张晓春，杨 琪，2，于 欢，2，席世涵，3，熊 磊，4，李成涛，张素华

（1.司法鉴定科学研究院上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台 司法部司法鉴定重点实验室，上海200063；2.苏州大学医学部法医学系，江苏苏州215123；3.内蒙古民族大学临床医学院，内蒙古通辽028000；4.内蒙古医科大学 法医学教研室，内蒙古 呼和浩特010030）

大 麻 （Cannabis sativa L.） 是 大 麻 科 （Cannabinaceae）大麻属（Cannabis）一年生雌雄异株的草本植物，偶有雌雄同株，主要分布于加拿大、意大利、印度以及我国的云南、新疆、黑龙江等地区。 大麻是一种多用途、多功能作物，其纤维是良好的纺织和造纸原料，植株内含有的多种化学成分被广泛应用于医药卫生领域， 种子中富含人体易吸收的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸与微量元素等多种营养成分，已成为许多国家重要的经济作物。 然而，大麻的花和叶中含有四氢大麻酚（Tetrahydrocannabinol，THC）这一具有强烈成瘾性和麻醉性的致幻成分，已被联合国禁毒公约列为与海洛因、可卡因并列的三大毒品之一。

大麻的毒性成分主要为THC，研究资料显示：当人类摄入THC 质量分数低于3 g·kg的大麻，不显示精神活性；只有摄入THC 质量分数高于3 g·kg的大麻，才具有一定的滥用倾向。 鉴于不同品种的大麻 THC 质量分数差别较大（0.1～200 g·kg），许多国家为防止大麻滥用，按植株内所含THC 含量并结合植株特征和用途，将大麻分为工业大麻/纤维大麻（THC＜ 3 g·kg）、中间型大麻（3 g·kg＜ THC＜5 g·kg）和毒品大麻/药用大麻（THC ＞ 5 g·kg）3种类型。 我国于2002 年在《云南省工业大麻管理暂行规定》中首次提出了工业大麻的概念，并将工业大麻称为汉麻或火麻，规定其THC 质量分数低于0.3 g·kg。 大麻是一种二倍体植物，共含有 20 条染色体（18 条常染色体和2 条性染色体），其雌株染色体为 XX 型，雄株染色体为 XY 型。 研究显示：大麻雌雄植株的利用价值并不相同，雄株的纤维质量明显高于雌株，但雄性植株中不含THC 或含量较低，雌性植株内THC 含量则相对较高，因此雌株具有药用价值和滥用可能。

目前，大麻是全球范围内种植、生产、贩卖和吸食最为广泛的毒品，也是国际社会普遍严禁的管制对象。 《中华人民共和国刑法》和《中华人民共和国禁毒法》也明确将大麻列为管制毒品，并采取严厉措施打击涉及大麻的违法犯罪行为。 然而，近年来受到国际上部分国家和地区（如乌拉圭、加拿大和美国阿拉斯加、科罗拉多、华盛顿等州）大麻合法化的影响，我国吸食和滥用大麻人数持续上升，境外走私案件也日益增多。因此，为打击毒品犯罪，对大麻进行快速、准确的司法鉴定已成为迫切的社会需求。 目前，常规的大麻鉴定方法主要是基于形态学和化学成分的分析。 但在实际案件中，大麻经过加工或与烟叶等混在一起，导致其在形态上无法识别。 对于大麻化学成分的分析，大多采用气相色谱-质谱联用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）对生物检材中的THC 进行定性和定量分析，但利用该方法分析大麻化学成分时，存在所需样本量较大且对检材质量要求较高，以及THC 在陈旧样本中易被氧化等局限性。此外，THC 的含量亦受大麻植株的年龄、性别和种植环境等因素影响，因而影响其化学分析的准确性。

随着分子生物学技术的快速发展，在DNA 水平上对物种进行鉴定已成为研究的热点。 鉴于常规的检测技术不能满足一些案件中大麻检材的鉴定需求， 法庭科学家尝试将DNA 遗传标记技术运用到大麻的鉴定中，并取得较为理想的效果。 本文针对近年来大麻遗传学的相关研究进行综述，旨在为司法鉴定和法庭科学中大麻的种属鉴定、个体识别及来源地推断的应用提供理论依据。

1 大麻DNA 遗传标记及其应用

1.1 序列特异性扩增区

大麻雌、雄植株的利用价值并不相同，只有雌性植株存在滥用倾向。 然而，陈旧的大麻样本、经过加工的大麻样本以及花期之前的大麻样本都无法从形态上准确判断其性别。 因此，利用遗传标记技术检测大麻性别对于大麻育种以及打击毒品犯罪均具有重要的意义。

序列特异性扩增区（Sequence-Characterized Amplified Region，SCAR）标记因其特异性高、重复性好等优点而被广泛应用于大麻性别研究。 SCAR遗传标记是在随机扩增多态性DNA（Randomly Amplified Polymorphic DNA， RAPD）和扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）标记的基础上衍生而得，兼具RAPD 和AFLP标记的优点。 新的SCAR 引物通常是在原有10 个碱基标记引物的基础上延长了目标基因组DNA 末端序列的14 个碱基构成，该过程不仅加强了与模板DNA 的特异性结合，还提高了退火温度以及转化后新标记的专一性。 MANDOLINO 等发现由随机引物OPA8 扩增产生的长度为400 bp 的RAPD序列与大麻雄性表型相关，并将此性别特异性RAPD标记转化为长度为 390 bp 的 SCAR 标记。 TÖRJÉK等利用20 条RAPD 引物分别对雌雄同株和雌雄异株大麻进行性别特异性遗传标记的筛选，发现引物OPD05 和引物UBC354 在雄性植株中产生了特异性条带，并将这两个雄性特异性RAPD 标记转化为SCAR 标记，命名为 SCAR323 和SCAR119。 TECHEN等根据MANDOLINO 等人的研究，使用一对与大麻雄性相关的引物MADC2 扩增大麻基因组DNA，在雌性和雄性植株中分别得到约450 bp 和约300 bp的片段，且DNA 分析结果与大麻雌雄植株外观形态学结果一致。这项研究结果表明，SCAR 遗传标记技术可作为大麻植株早期发育阶段的性别鉴定技术。

SCAR 遗传标记技术应用于大麻的性别研究在国内也有所开展。陈其军等用30 对随机引物对雌雄异株大麻——“云麻一号”进行扩增，得到一条约2.5 kb 的雄性特异性片段，并根据测序结果将其转化为重复性和特异性更好的SCAR 标记。 李仕金等以“云麻一号”为实验材料，利用200 条RAPD随机引物进行大麻性别相关位点的筛选，结果显示，引物S208 扩增得到一条大小为429 bp 且与大麻雄性相关的特异性条带。 根据测序结果合成了2条SCAR 标记引物，该SCAR 标记可对已知性别花期和未知性别幼苗期的大麻植株进行准确的性别鉴定。 张贵芹 等使用 TÖRJÉK 等人开发的SCAR 标记引物，对我国4 个不同地区的120 株已知性别的大麻样本进行特异性检测并随机抽取样本进行盲测研究。 结果显示：120 株已知性别的大麻样本中有113 株样本检测结果正确，准确率为94.2%；16 株盲测样本中有15 株样本检测结果正确，准确率为93.8%。

上述研究表明，SCAR 标记可作为大麻性别鉴定可靠而稳定的遗传标记，但已转化的SCAR 标记并非都能成功用于大麻性别的鉴定，其准确性仍需进一步验证。 此外，由于大麻品种多达150 余种，已开发的SCAR 性别连锁标记是否具有广泛的适用性还需进一步验证。 由于在研究已开发的大麻SCAR 遗传标记中并未发现雌性特异性引物， 因此有必要进一步开发雌性特异性标记，以提高大麻性别鉴定的准确性。

1.2 DNA 条形码

DNA 条形码是由加拿大动物学家HEBERT等于2003 年首次提出，是指通过一段短而标准的DNA 片段作为遗传标记来实现快速、准确、自动化的物种鉴定。 与传统的依赖形态学进行物种鉴定的方法相比，DNA 条形码不受鉴定对象的环境、发育阶段以及人为等因素的影响，且对鉴定人员的专业知识要求不高，一经提出就被广泛应用于动物、植物以及微生物领域的物种鉴定。 2009 年，生命条形码联盟（the Consortium for the Barcode of Life，CBOL）植物工作组推荐将叶绿体DNA（chloroplast DNA,cpDNA）片段成熟酶 K（maturase K, matK）和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,rbcL）作为鉴定陆生植物的通用条形码。 然后，又将叶绿体间隔区psbA-trnH 和核糖体DNA 的内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）作为植物的补充条形码。

DNA 条形码技术已广泛应用于各个领域的物种鉴定，MELLO 等利用 rbcL 序列引物对 24 例产自巴西的毒品大麻样本进行PCR 扩增并测序，结果显示，24 例大麻样本具有相同的rbcL 序列，且将该序列在NCBI 上进行BLAST 相似性检索，发现测序所得序列与数据库中大麻的rbcL 序列相似性高于99%，因而可确认其为大麻。 该研究结果表明，rbcL序列可作为鉴定毒品原植物大麻的DNA 条形码，且该序列能将产自巴西的大麻样本与产自中国、美国和英国的样本相区分。ROMAN 等根据GenBank数据库中大麻cpDNA 全基因组序列筛选出2 个热点区域rp132-trnL 和trnS-trnG，并对5 个不同组别（美国纤维大麻、加拿大纤维大麻、美国-墨西哥毒品大麻、智利毒品大麻、智利医用大麻）的大麻样本进行遗传多态性分析，尽管超过80%的样本具有相同的序列，但在5 个样本组之间仍然观察到特异性差异，这表明rp132-trnL 和trnS-trnG 标记在确定大麻样本来源及样本类型方面具有一定的作用。

国内应用DNA 条形码技术主要是对大麻及其混伪品进行鉴别，宋炳轲等利用psbA-trnH 和ITS2 序列对产自5 个不同地区的大麻样本及其混伪品进行鉴别。 ITS2 序列分析显示：不同地区的大麻ITS2 序列完全一致，未发现变异位点，且通过BLAST 检索可鉴定为大麻；psbA-trnH 序列分析结果表明，该序列不但可鉴别不同地域来源的大麻，还可分辨出大麻的性别并区分野生型与栽培型。 代勇等对采自云南的工业大麻和新疆的毒品大麻进行ITS 全序列分析，通过序列比对显示：新疆大麻与云南大麻ITS 序列具有22 个变异位点，从构建的系统发育树可看出，新疆毒品大麻与云南工业大麻亲缘关系较远。 该研究结果表明，基于ITS 全序列分析能够准确地区分出毒品大麻与工业大麻。

DNA 条形码技术的应用主要是快速准确地进行物种鉴定，上述研究均表明DNA 条形码可作为鉴定大麻的遗传标记，且对于确定大麻来源及样本类型方面也具有一定的作用。 我国对于DNA 条形码的研究起步相对较晚，且对于大麻的鉴定研究也不够深入。 为了获得更多的遗传信息，CBOL 植物工作组提出需要用多个遗传标记组合作为植物物种鉴定的标准条形码。 因此，在今后的研究中，应扩大DNA 条形码在物种中的应用范围，开发更多的条形码序列，以建立一个属于我国生物物种的条形码数据库，这对于物种鉴定以及保护我国物种多样性方面均具有重要的意义。

1.3 短串联重复序列

短串联重复序列（Short Tandem Repeats，STR）也称微卫星DNA（Microsatellite DNA）或简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），是由 2～6 bp的核心序列串联组成的寡核苷酸序列，因其具有高灵敏度、高鉴别能力、高种属特异性、高准确性以及易于标准化等优点，而被广泛应用于司法鉴定领域的个体识别、亲缘鉴定和群体调查，并成为法庭科学领域中应用最为广泛的遗传标记。 目前， 植物STR 遗传标记主要用于植物个体识别、 种属鉴定、遗传多样性分析和遗传图谱构建等多个方面。 李慧峰等利用10 对多态性良好的STR 引物对山东省原产的苹果资源进行分析，其中共检测到139 个等位基因及244 种基因型。 该研究成功构建了山东苹果种质的分子身份证，为山东省苹果资源的鉴定工作提供了重要依据。 李元元利用STR 标记构建了包含3 个基因座的罂粟荧光复合扩增检测体系，并证明该体系能够将罂粟与其近缘物种及混伪品相区分。

大麻可通过种子种植和克隆繁殖2 种方式进行栽培。 种子种植产生的大麻植株具有其特有的基因型，而克隆产生的植株具有与“母性”个体相同的基因型。在一些特殊案件中，通常既需要对大麻检材准确鉴别，又需要对大麻样本进行个体化识别。据此，国内外一些学者尝试将STR 遗传标记应用到大麻鉴定中，并证明了其在大麻个体化研究中的潜力。2003 年HSIEH 等报道了第一个大麻STR 基因座CS1，为一个六核苷酸重复序列STR 基因座，该基因座在108 株大麻样本中的重复单位个数为3～40个，杂合度约为87.04%，这表明基因座CS1 具有高度多态性。在此之后有更多的大麻STR 基因座被开发出来，如 ALGHANIM 等开发了 C11-CANN1、B01-CANN1 和D02-CNAA1 等11 个具有多态性的 STR基因座；VALVERDE 等开发了 5159、4910 和 1528等6 个四核苷酸重复STR 基因座，这也是首次报道的大麻四核苷酸重复STR 基因座。

此外，大麻STR 基因座复合扩增体系的研究也随之展开。 HOWARD 等根据先前的研究报道，筛选到 ANUCS301、ANUCS302 和 ANUCS303 等 10 个大麻STR 基因座，并成功构建了大麻STR 基因座复合扩增体系，首次根据SWGDAM 验证指南对该体系进行灵敏度、稳定性以及物种特异性等方面的研究。 VALVERDE 等对 15 个大麻 STR 基因座的不同等位基因进行测序分析，并根据国际法医遗传学会 （International Society for Forensic Genetics，ISFG）准则首次提出了大麻STR 基因座的命名方案——基于核心序列重复次数的命名法。 测序结果显示：D02-CANN1、B05-CANN1、B02-CANN2、E07-CANN1 和ANUCS501 为简单而稳定的基因座，这也是法医学中推荐使用的STR 基因座；基因座 H09-CANN2、H11-CANN1 和 ANUCS308 为二核苷酸重复，其表现出高stutter 峰和杂合子不均衡，且基因座ANUCS308 还被报道在33%的样本中出现丢失现象，因此并不推荐使用这3 个基因座用于大麻STR 复合扩增体系的构建。 HOUSTON 等筛除了上述性能较差的STR 基因座并结合VALVERDE 等开发的6 个四核苷酸重复基因座，成功构建了包含13 个基因座的STR 复合扩增体系，并证明该体系可用于大麻样品的鉴定分析。

目前，国内对于大麻STR 基因座的研究才刚刚起步，关于大麻复合扩增体系的研究还不够深入。马原等选取扩增条件相近、杂合度较高的3 个基因座 ANUCS301、ANUCS305 和 CS1 对大麻进行个体和群体遗传多态性分析。 结果显示，所构建的大麻STR 基因座荧光扩增检测体系具有良好的组织同一性，基因座CS1 和ANUCS305 具有良好的种属特异性，且CS1 具有高度多态性，ANUCS305 具有中度多态性。该研究为利用STR 遗传信息推断毒品原植物大麻的品种和产地提供了理论基础。

贩毒案件中查获的大麻检材，多为同一产地或者不同产地的一种或者几种，如果能对大麻进行准确的种属鉴定和个体识别，不仅可帮助警方打击毒品犯罪，还使得不同地区贩毒案件的毒源追踪成为可能。 上述研究表明，STR 基因座复合扩增体系可对大麻进行种属鉴定、个体识别及来源地推断。 但目前为止，国内外已开发的大麻STR 基因座较少，仅有33 个，其中法医遗传学中常用的四核苷酸重复基因座仅有6 个，且对于大麻STR 基因座复合扩增体系的研究仍处于初级阶段，也尚未建立一个全球通用的大麻STR 数据库。 因此，仍需投入更多的时间、人力和财力去开发符合要求的STR 基因座，这也在一定程度上制约了STR 遗传标记在大麻研究中的应用和发展。

1.4 单核苷酸多态性

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指基因组中特定部位单个核苷酸变异引起的DNA 序列多态性，被称为第三代DNA 遗传标记。 与第一代遗传标记RFLP 及第二代遗传标记STR 截然不同，SNP 是单个碱基的转换和颠倒。SNP 作为目前最具发展潜力的遗传标记，因具有数量丰富、分布广泛、突变率低以及易于实现大规模自动化检测等优点，已被广泛应用于分子遗传学、动植物遗传育种、法医遗传学、疾病诊断和治疗等众多应用领域。 刘易科等利用90 K SNP 芯片技术对国内240 个小麦品种进行全基因组扫描，分析其遗传多样性。 结果显示，我国各省市间小麦种质资源交流较为频繁，但部分品种遗传相似度较高，因此急需引入新的小麦种质，拓宽遗传基础。

目前，通过全基因组测序技术获得多态性SNP位点已在水稻、小麦、玉米等农作物中广泛应用，但针对大麻SNP 的研究甚少。ROTHERHAM 等基于四氢大麻酚酸（Tetrahydrocannabinol acid, THCA）合酶基因中399 bp 片段内的4 个多态性位点，运用SNP 技术对94 株大麻样本（包含10 株未知样本）进行测序。 结果显示，该研究开发的SNP 测定法能够以100%的成功率识别毒品大麻样本，同时还能区分大麻和其他物种。 SOORNI 等使用简化基因组的测序方法对98 株大麻样本进行酶切、测序和分型，结果共检测到24 710 个高质量的 SNP 位点。 样本间分析结果显示，纤维大麻与毒品大麻之间的遗传差异并不局限于THCA 合酶基因中，而是广泛分布于整个基因组中。 陈璇等基于全基因组重测序技术对采自中国的野生型和栽培型大麻进行全基因组重测序，并通过与大麻参考基因组（Cansat3_genome）进行比对，共检测到 2 264 150 个SNP 位点。 该研究结果表明，野生型大麻与栽培型大麻在基因组水平上存在一定的差异，这为野生型和栽培型大麻遗传分离群体的构建及遗传标记的开发提供理论基础。

SNP 作为新一代分子标记，以其数量多、分布广、遗传稳定性高以及易于自动化分型等优点，被广泛应用于多个领域。随着SNP 分型检测方法的不断进步，特别是与DNA 芯片技术相结合，使得检测的准确性更为可靠。现阶段SNP 技术应用于大麻的研究更多的存在于理论方面，但对于其他物种的研究已较为成熟。 因此，未来应用测序技术开发出更多能把不同地区、不同品种的大麻鉴别出来的SNP位点就显的十分必要，而且利用SNP 所具有的基因定位功能，使得毒源追踪成为可能。

2 总结与展望

毒品问题仍然是当今世界面临的重大社会问题之一，无论在中国还是在世界范围内，该问题都对人类的生存和社会的发展构成了严重的威胁。 目前涉及大麻类检材的鉴定大多采用GC-MS 对生物检材中的THC 进行定性和定量分析，然而在特殊情况下（如大麻的缉获量极少、化学分析未检测到THC、幼苗期大麻、需要分析大麻种子和根等），常规的检测方法可能会影响鉴定结果的准确性。 此外，在一些大麻犯罪案件中，既需要将案件检材进行鉴定，又需要对样本进行个体化分析以推断毒源，常规的检测方法无法满足需求。 大麻遗传标记的研究弥补了大麻形态学及生化检测技术的不足，其中SCAR 遗传标记对于大麻性别的鉴定具有较好的稳定性和特异性，被广泛应用于大麻性别研究。 尽管对于大麻DNA 条形码的研究较少，但rbcL 序列、psbA-trnH 序列、ITS2 序列均被证明可作为大麻种属鉴定的DNA 条形码，但上述遗传标记均不能解决大麻个体识别及来源地推断等问题。 就笔者所知，STR 是目前唯一一个被应用于大麻个体化识别的遗传标记，然而我国对于大麻STR 基因座复合扩增体系的研究仍处于空白阶段。 SNP 作为第三代遗传标记，可鉴别出不同个体间的遗传差异，但现阶段SNP 技术应用于大麻的研究更多存在于理论。

由于样本获取受限，国内外对于大麻DNA 遗传标记的研究仍较缓慢，我国法庭科学也尚未有对大麻种属鉴定和个体化识别的DNA 鉴定标准。 因此，大麻遗传标记的研究尤其是STR 基因座的开发以及复合扩增体系的构建仍需不断完善，期望随着大麻STR 数据库的建立与完善，能够实现全球大麻信息共享，便于大麻的毒源追踪，并探索出适用于我国大麻鉴定的DNA 鉴定标准。 此外，随着对大麻SNP 的深入研究，期望开发出更多能鉴别不同地区、不同品种大麻的SNP 位点，为警方查找毒品来源、铲除毒品种植基地提供线索。