骨骼肌circRNA 在死亡时间推断中的初步筛选及验证研究

董婷婷，肖作润，刘增甲，王业全，张国安，崔 文

（济宁医学院 法医学与医学检验学院，山东 济宁 272067）

死亡时间或死后间隔时间（postmortem interval，PMI）是指尸体被发现时距离死亡时的时间间隔。死亡时间的准确推断在可疑死亡案件中，对于排查和确定犯罪嫌疑人至关重要。 因此，死亡时间的推断研究一直是法医学研究的热点，也是目前研究的难点。 传统的法医病理是通过尸斑、尸僵、尸温等尸体现象的变化推断死亡时间，但因其易受外界环境因素的影响，造成死亡时间的推断误差较大。 因此，寻找准确推断死亡时间的方法对于法医实践中的应用至关重要。

近年来，利用RNA 的降解程度来推断死亡时间已逐渐成为法医学研究热点。 LI W 等发现在大鼠的心肌组织中，线性RNA 在死后的96 h 内呈现平稳增高的趋势，适合用于PMI 推断。 但是国内学者吕叶辉等研究发现大鼠心肌内多种线性RNA 的表达受死亡原因的影响，且RNA 易降解，增加了其提取和检测的困难，并不适合进行推广应用。

环状 RNA（circular RNA，circRNA）是一类以共价键形成的闭合环状结构的非编码RNA 分子，不具有5' 端帽子结构和3' 端poly A 尾。 RNase R 可以识别线性RNA 游离的3' 端，从而对其进行降解，而circRNA 由于其环状结构，并不能被RNase R 所识别，故与传统线性RNA 相比，其具有更高的稳定性。 本实验利用其稳定性这一特点，以期筛选出与死亡时间具有相关性的circRNA，用于法医实践中对死亡时间的推断。

1 材料与方法

1.1 样本

从济宁市公安局和济宁医学院司法鉴定中心收集18 例死亡时间在24 h 以内的个体并提取其肋间肌。 选入标准：（1）死亡时间在 24 h 以内，直至尸体被剖验时为常温保存；（2）排除遗传性疾病及其他免疫性疾病和恶性肿瘤，以防影响circRNA 表达量检测的准确性；（3）尸体均为交通意外或刑事案件受伤后死亡，取材部位无损伤（表1）。 每例均详细记录其死亡时间、死因、年龄、性别等资料。 然后放置在人工气候箱内，模拟外界环境（温度18 ℃，湿度60%），首先从济宁市公安局的刑事案件中心收集芯片实验选取2 例，皆因外伤死亡，已知死亡时间在 24 h 以内，分别于尸检即刻（12 h 以内）、3、5、7、10 d 各取 50 g 肋间肌进行实验，用于制作circRNA 表达谱。 后期收集的18 例分别在尸检即刻（12 h 以内）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d 等时间点定点取样，并立即置于液氮中冻存，最后统一进行总RNA 提取，并进行后续实验。 收集到的上述样本经济宁医学院伦理委员会审查批准， 且符合相关规定。

表1 样本个体详细信息表

续表1

1.2 方法

1.2.1 基因芯片实验

本实验由上海康成生物有限公司协作完成，主要实验步骤包括：

（1）样本 RNA 抽提：采用 Tri20L 进行 RNA 提取（invitrogen）；（2）RNA 质量检测：测 OD 值计算浓度并评估纯度（OD260/280 在 1.8～2.0 之间），琼脂糖凝胶电泳检测RNA 纯度及完整性；（完整性比较好的总RNA 琼脂糖凝胶电泳图呈现3 条带，且3 条带清晰无严重拖尾）；（3）使用 RNase R（Ribonuclease R，核糖核酸外切酶）（吉赛生物，R0301）消化线性RNA 分子；（4）使用逆转录试剂将去除线性 RNA 的RNA 反转录为带有T7prometer 的 cDNA 序列，然后再将cDNA 转录成带有荧光标记的 cRNA 序列；（5）标记效率质量检测：使用Nanodrop 检测荧光标记效率；（6）芯片杂交：在标准条件下将标记好的探针和高密度基因组芯片进行杂交；（7）图像采集和数据分析：使用GenePix 4000B 芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数据型数据保存。

1.2.2 具有显著差异表达的circRNAs 的筛选

采用 P 值小于 0.05（P＜0.05）、差异表达倍数绝对值大于等于2（|logFoldChange|≥2）筛选出具有显著差异的circRNA； 将差异circRNA 进行STEM 分析，进一步筛选出整体为下降趋势的circRNA； 将上述筛选的circRNA 进行热图分析，最终筛选出随死亡时间的增加，相对表达量具有显著差异的circRNAs。

1.2.3 引物设计

通过 cirbase 数据库（http://www.circbase.org/）获得circRNA 的序列，若序列太长则取首尾各150 bp进行拼接，末尾150 bp 作为拼接后的首序列，将该300 bp 序列用primer-blast 进行引物设计，具体参数根据引物设计原则进行设置，然后选择引物（circRNA PCR 产物必须包含首位拼接位点）。若有已报道circRNA 引物，则采用文献中引物。

1.2.4 内参基因选择

在样品处理过程中，RNA 水平的轻微变化都可以导致靶基因相对表达量的趋势改变，而降解组织中又不存在合适且稳定的参考基因。 大量数据表明miRNA 在死后组织中较为稳定，进一步研究发现mir-133a 作为参考标志物为最佳。 因此，本研究对常用 GAPDH、β-Actin、mir133a-3p 的稳定性进行研究，以筛选出最佳参考基因。

1.2.5 实时荧光定量RCR

本研究中Ct 值范围在15～35 之间，每个样本做 3 个复孔，复孔间 Ct 值 STD＜0.2。

（1）取备检组织样本采用 trizol（Invitrogen 公司）法提取总RNA，按说明书操作。 然后进行电泳检测其降解程度。 用NanoDrop2000c 紫外可见分光光度计检测其纯度及浓度。 采用mRNA 反转录试剂盒（TAKARA 公司），将 RNA 反转录为 cDNA 第一链，然后放置在-80℃下备用。（2）将上述的cDNA 样本，应用 TB Green Premix Ex Taq II （TAKARA 公司），在QuantStudio 7 Flex 实时荧光定量PCR 仪系统上进行检测，反应总体系20μL；反应程序参数：预变性 95 ℃ 30 s 后，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s 共 40 个循环。溶解曲线步骤：95 ℃ 5 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；冷却温度 50 ℃ 30 s。

1.3 统计分析

以△Ct 等于目的基因的CT 值减去内参基因的CT 值，△△Ct 为不同死亡时间的△Ct 减去死亡当天（12 h 以内）的△Ct 所得，以 2代表目标circRNA 在不同时间点相对死亡当天（12 h 以内）的差异表达倍数。 应用SPSS13.0 软件进行统计学处理，实验结果以x±s 进行描述。 两个时间点之间的结果进行比较，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 芯片实验结果

火山图（图 1）由 log（FC）及-lg（P 值）所组成，水平线代表P 值，垂直线代表相对表达量上调或下调2 倍。图中的红点代表具有显著差异的circRNAs。将第3、5、7、10d 的结果与死亡当天（12h 以内）相比，第 3 天具有差异表达的circRNAs 数目最多。

图1 火山图

2.2 基因芯片筛选结果

STEM 分析结果发现部分circRNAs 相对表达量表现为先上升、后下降的趋势（图2），部分circRNA 则一直呈下降趋势（图3）。

图2 芯片结果中具有随死亡时间的进行，其相对表达量先升高再降低的基因簇

图3 芯片结果中具有随死亡时间的进行，其相对表达量降低的基因簇

2.3 热图聚类分析

热图分析结果显示为四个部分：热图、横轴和纵轴、色键。 横轴为样本，纵轴为基因名称，热图中每一个小格代表一个基因，颜色则表示为该基因的表达量。 色键即用于查看基因表达量的对比键，红色代表高表达量，绿色代表低表达量。 实验结果展示了表达量具有显著差异的circRNAs（图4）。

图4 具有差异表达的circRNA 聚类图

2.4 差异表达基因的筛选

对热图分析筛选出的具有相同变化趋势的circRNAs 进行进一步分析，随死亡时间推移，在10 d内整体呈下降趋势的circRNAs 有hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_000 5251、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0001946、hsa_circ_0001971 7 个，具体信息如表2。

表2 随死亡时间表达下调的circRNAs

2.5 结果

2.5.1 引物序列信息

根据设计及查找所得序列如表3。

表3 引物序列

2.5.2 琼脂糖凝胶电泳结果

根据引物序列进行PCR 实验后，电泳结果显示每对引物特异性良好，均表现出单一条带，且无二聚体产生，引物可用于后续实验（图5）。

图5 电泳图

2.6 内参基因的选择

根据NormFinder 软件筛选，结果发现mir133a-3p 为在骨骼肌中最稳定的内参基因（n=18，mir133a-3p vs GAPDH、mir133a-3p vs β-Actin，***P0.001）（图 6）。

图6 不同内参基因稳定性分析结果

2.7 各目的基因的相对表达量随死亡时间的变化

根据所筛选基因进行Q-PCR 实验， 结果发现与死亡当天（12 h 以内）相比，在10 d 内整体呈下降趋势的基因有5 个，分别为hsa_circ_0000284、hsa_circ_000 5251、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871（n =18，* P＜ 0.05，**P＜ 0.01，***P＜ 0.001）（图7）。

图7 各目的基因的相对表达量随死亡时间的变化

3 讨论

因circRNA 具有组织特异性及高度稳定性，目前在肿瘤、衰老、炎症等方面研究较多，成为当今研究的热点。 MENCZAK 等研究证实 circRNA 具有一定的组织、时序和疾病特异性，且对RNase R 具有较强的耐受性，不易受其降解。 FU 等研究发现hsa_circ_0005986 可以与 miR-129-5p 结合，起到miR-129-5p 海绵作用，从而抑制肝癌的发生，成为肝癌新的生物标志物。DU 等发现circ-Foxo3 可通过抑制蛋白的抗衰老作用，使心肌细胞快速衰老。

circRNA 虽在多个领域的研究获得突破，但其在法医学方面进行应用研究的报道极为少见，尤其是利用其结构稳定性、序列保守性及细胞或组织特异性表达等进行的相关研究。 赵禾苗等根据circRNA 表达的组织特异性，选取了两个circRNAs 进行实验，发现其在唾液、阴道分泌物、精液中广泛存在，但具体的组织特异性circRNA 分子，仍在进一步的探索中。 死亡时间推断一直以来是法医学研究的热点及难点。 截至目前，虽已有多种死亡时间的推断方法，但均易受外界环境因素的影响，导致推断结果出现较大误差，严重影响案件的开展。 故此，法医实践工作中急需寻找一种准确推断死亡时间的方法。 本研究利用circRNA 的结构稳定性、序列保守性及细胞或组织特异性表达等特点，查找表达量高，稳定性强，表达量与死亡时间的变化呈一定规律的circRNA，为在法医实践中准确推断死亡时间提供重要的参考依据。

肌肉组织是人体中最丰富的组织，在被皮肤较好保护的同时又容易提取。与内脏和神经组织相比，骨骼肌在死后变化方面有较大的延迟，但其分解速度仍比软骨和骨骼要快。 因此，肌肉组织宜于在法医实验室进行常规分析，是推断中晚期死亡时间的一个常见候选组织。 本研究选用了分布范围较广，有肋骨保护，且与机体内外充分接触的肋间肌作为研究对象进行死亡时间推断研究。 结果表明肌肉组织可用于中晚期死亡时间推断研究。

本实验应用了实时荧光定量PCR 技术检测circRNA 含量，因其灵敏度高、设备使用范围广、分析方法商业化等优点被认为是检测RNA 的一种良好方法。此外，实时荧光定量PCR 结果的准确性很大程度上取决于内参指标的标准化，选取稳定的内参指标可以排除个体差异带来的误差，使统计结果更加客观、准确。 对于人体样本，找到合适的内参指标用于RNA 表达水平的准确定量至关重要。

已有报道称在小鼠骨骼肌组织中miR-133a 和circAFF1 较为稳定。通过查找小鼠mir-133a 序列，发现人miR-133a-3p 为其同源序列。 通过研究发现在降解的肌肉组织中，miR133a-3p 与常用的GAPDH、β-Action 相比，较为稳定，适合作为该类实验内参基因。

基因芯片技术作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，具有以下几个方面的特点：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种基因。 每一个circRNA 对应一个剪接点探针，能准确可靠地检测单一circRNA，即便在对应线性RNA 存在的情况下也具有高特异性。circRNA 芯片目前涵盖了人和小鼠的circRNA 位点。 本研究通过circRNA 芯片筛选得到了较多的circRNA，更有利于对circRNA 差异表达谱进行全面、准确的分析。 通过筛选最终发现hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727 等 7 个与死亡时间具有负相关性的circRNAs。但在后续的验证实验中发现只有其中五个circRNAs 相对表达量随死亡时间变化具有显著差异，分别为hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0001871，但hsa_circ_0001871 表现为先上升后下降的趋势，提示只有部分的circRNA 降解具有稳定的规律性变化，可根据其降解速度进行死亡时间的推断。

目前，circRNAs 相对表达量上升或下降的机理并不明确。 在正常生理情况下， JECK 等将circRNA的形成机制总结为“套索驱动环化”模型，及“内含子配对驱动环化”模型，circRNA 来源于外显子跳跃（exonskipping）事件，其会产生一个包含外显子的套索结构（exon-containing lariat），然后再经过内部拼接成一个由外显子组成的circRNA。由此可见，任何外显子跳跃事件都具有形成circRNA 的潜能，同时长侧翼（long flanking introns）及丰富的ALU 重复序列都会增加其环化的能力。 LASDA 等研究认为，circRNA 的降解机制或许和胞外囊泡共沉淀有关，circRNA 通过囊泡作用运输到胞外，然后胞外囊泡被其他细胞吸收，从而使得circRNA 被降解。 但也有研究发现，作为RNA 编辑因子（RNA-editing factor）的ADAR1 对有外显子环化来源的 circRNA 具有抑制作用，敲除其所在位置的基因发现，部分circRNA 的表达量有所上升。 部分 circRNA 也可作为内源竞争性RNA 在体内被小干扰RNA（Small interfering RNA;siRNA）所降解。 最新的研究表明m6A 可以识别蛋白 YTHDF2 结合靶分子，募集HRSP12，进而介导RNA 内切核酸酶RNase P/MRP复合物切割靶分子，而这一过程可以作用于mRNA和 circRNA。 由此可见，对于 circRNA 的降解机制，目前仍没有统一明确的解释，仍需进一步研究探讨。

本实验中也同时发现，部分circRNA 分子表达量的变化与死亡时间无相关性，如hsa_circ_ 0001946、hsa_circ_0001971，考虑或许是其受外界其他环境因素的影响所致，后续将继续增加样本数量，设置更多变量，寻找更加稳定的circRNA 分子，以建立更加科学的数学模型，达到准确推断死亡时间的最终目的，从而为死亡时间的推断开辟一条新的路径。

本实验筛选出了5 个随死亡时间延长呈稳定下降趋势的circRNAs，可用于死亡时间的推断研究。 circRNA 的稳定性使其在陈旧、腐败降解检材的检测中具有巨大优势，可以作为新兴的法医鉴定分子标记使用。