酶解禽类蛋白制备呈味基料的研究进展

李自会，张顺棠，段晓杰,*，布冠好*，刘昆仑，高立栋，井金峰

(1.河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001；2.莲花健康产业集团股份有限公司，河南 项城 466200)

中国饮食文化源远流长，调味料是中国传统特色产品。随着人们生活水平的提高，饮食安全、健康、营养受到越来越多的重视。然而，当前市场上的调味料品质参差不齐，因此开发营养型调味料具有广阔的前景。禽肉是我国蛋白质消费的主要来源之一，禽肉及其骨骼中含有多种复杂的鲜味成分，具有浓郁的味道，可作为食品的原料或呈味基料用于调味料的生产中，满足人们的消费需求，促进食品工业的发展[1]。因此，以禽类蛋白为原料，利用技术手段开发营养、健康、味道鲜美、浓郁天然的调味料具有重要意义。

蛋白质酶解是蛋白质在蛋白酶的作用下被水解成小分子肽或氨基酸的过程。酶法水解具有反应条件温和、专一性强、安全性高、高效环保、能较好保留酶解产物生物活性等优点，已成为食品加工领域用于改造和提高蛋白质价值的重要方法之一[2]。禽类蛋白经酶解后产生的氨基酸和多肽不仅可以提高蛋白质的吸收利用率，而且能增强抗氧化、降血压、抗疲劳等功效，还可以增强风味[3]。

近年来，蛋白质酶解技术被广泛应用于调味料领域。蛋白质经过适度酶解后产生的氨基酸和小分子肽，可与味蕾细胞接触呈现甜、苦、鲜、酸等味道。此外，氨基酸和多肽是加工食品的风味和芳香化合物形成的前体物质，热反应后能有效提高香气。蛋白酶解物风味天然、浓郁，且具有营养价值，成为高档调味料研究和发展的一个重要方向[4]。

本文对禽类蛋白的酶解工艺、酶解产物中的呈味物质以及呈味肽的分离纯化与鉴定进行了综述，以期为酶解禽类蛋白制备呈味基料提供理论依据，促进调味料行业的高质量发展。

1 禽类蛋白的酶解工艺

蛋白质的酶解主要是蛋白酶作用于蛋白质的肽键，使蛋白质逐渐水解为多肽、小分子肽、游离氨基酸等。生物酶法制备的呈味肽具有安全性高、反应条件温和、可控性强等优点，已成为制备呈味肽的常用方法[5]。

目前以鸡肉作为底物酶解制备调味基料的研究报道较多，而以鸭肉、鹅肉和禽骨为底物的研究相对较少。以禽肉为底物得到的产品香味浓郁，但是成本较高。禽骨中含有丰富的蛋白质、脂质、矿物质等营养成分，是一种营养价值高的肉类加工副产物。酶解禽骨生产呈味基料，成本相对低，但是风味较淡。针对酶解单一底物存在的弊端，孙丽霞等[6]以鸡脯肉和鸡骨架为复合底物进行酶解，在提升产品风味的同时降低了生产成本。

酶解方式主要包括单一酶水解、复合酶水解和辅助酶解(见表1)。在酶解过程中，酶解条件如温度、pH、加酶量、料液比等存在复杂的交互作用，影响水解效果和产物的风味特征。此外，在加热灭酶过程中，随着温度的逐渐升高，酶解体系中会发生分解、氧化、还原等前体物质的化学反应。常使用的灭酶条件为75～100 ℃，10～25 min。

表1 酶解禽类蛋白制备呈味基料

1.1 单一酶水解

蛋白酶根据来源可以分为植物蛋白酶、动物蛋白酶和微生物蛋白酶。不同的蛋白酶具有不同的酶切位点，酶的选择可以直接影响蛋白质的水解度、酶解产物肽分子量大小、游离氨基酸组成以及酶解液风味和营养价值等[16]。目前用于禽类蛋白呈味研究的酶主要有碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶。

为了获得理想的风味前体物质，特别是游离氨基酸和多肽，需控制水解度和水解时间以获得合适的禽类蛋白酶解物[17]。Zhang等提出由复合蛋白酶FH-G-NA-XII和胰蛋白酶同步酶解3～6 h得到的鸡肉蛋白水解物可能是食品工业生产理想鸡肉风味的前体物质。Dong等[18]发现8 h是风味酶水解鸡骨生产氨基酸的最佳时间，这种差异可能是酶解原料不同以及不同蛋白酶的酶活性和酶切位点不同造成的。于亚辉等研究发现，经单一酶酶解后的鸡肉酶解液水解度为10%～20%，其中动物蛋白酶的酶解效果最佳，水解度为19.21%，得到的酶解液中鲜味、甜味氨基酸含量相对较高，这可能是由于动物蛋白酶含有内切酶、外切酶以及风味酶，因此整体酶解效果好。复合蛋白酶主要含内切酶，水解度较高，但产物中多含有低聚肽，易产生苦味。风味蛋白酶可以通过选择性酶切苦味肽的N-端或C-端肽键，使游离的疏水氨基酸释放出来，从而降低苦味，改善酶解液风味[19]。

另外，不同品种以及不同部位的鸡肉水解度和风味差异显著，其中鸡胸肉酶解物的水解度最高，鸡骨架最低；淘汰蛋鸡不同部位之间以鸡骨架酶解液的美拉德反应产物呈味效果最好[20]。

1.2 复合酶水解

单一酶水解虽然操作简单、成本较低，但由于酶切位点单一，故酶解液的水解度不高，酶解时间较长，另外经单一酶水解的热反应产物的香气不突出。当仅用一种酶难以达到预期效果时，可以将两种或几种酶结合形成复杂的酶系统。复合酶水解相对于单一酶水解可显著提高酶解液的水解度，且特征香更加明显，因此多采用复合酶水解制备呈味基料[21]。复合酶水解分为多酶同步水解和多酶分步水解。

有研究发现，分步水解与同步水解对鸡骨酶解物的影响并不显著，为了简化工艺，采用同步酶解工艺。单一风味酶能有效降低酶解产物的苦味，但其缺乏足够多的酶切位点，因此酶解液的水解度较低。一般采用风味蛋白酶与其他内切酶复配酶解禽肉或禽骨，得到的酶解液水解度为20%～40%，且风味的感官评价较好。

邱燕翔等发现经风味蛋白酶酶解制得的鸡肉酶解液水解度为20.1%，且香气纯正，无明显苦味；而经复合蛋白酶酶解制得的酶解液水解度为28.7%，但香气较淡，苦味较重，最终采用在不灭酶条件下复合蛋白酶与风味蛋白酶按1∶2分步酶解鸡胸肉，水解度达到了48.8%，制得的酶解液香气浓郁，无明显苦味。

1.3 辅助酶解

近年来，越来越多的研究表明，一些辅助手段与生物酶解技术结合使用可以缩短酶解时间，提高酶解效果。辅助酶解手段主要包括超声波、微波、超高压等，目前多以超声辅助酶解技术水解禽类蛋白。

超声波是一种绿色技术，主要通过空化效应来改善蛋白质的性质[22]。超声波在反应过程中产生的气泡经过挤压破裂，能在瞬间产生较强的机械剪切力，对液体介质中的大分子产生机械性断键作用，从而促使更多亲水基团暴露，有利于底物与酶的结合，提高蛋白质的水解程度，达到预期的效果。有学者采用超声辅助碱性蛋白酶和风味蛋白酶分步酶解鸡骨架，先调节pH至8.5，添加0.2%的碱性蛋白酶，55 ℃下恒温酶解1.5 h后，再将pH值调节至7，向其中加入0.2%的风味蛋白酶，50 ℃下恒温酶解1.5 h，确定了最佳辅助条件为超声功率800 W、超声时间30 min，此条件下，水解度达到了24%，经超声处理后鸡骨酶解液中鲜味氨基酸含量增加，鲜味增强。

超高压、微波和酶解相结合可以提高原料的利用率，缩短酶解时间，提高蛋白水解度和酶解效率，改善植物蛋白酶解产物的风味[23-24]。但目前采用超高压或微波辅助酶解技术改善禽类蛋白酶解物风味的研究鲜有报道。

2 酶解产物中呈味物质研究

禽类蛋白经蛋白酶水解后，呈味物质如氨基酸、肽、挥发性风味物质等的组成和含量发生改变，从而影响酶解产物的呈味特性。

氨基酸在生物的生长和发育中起着重要作用，并且可以增强食物的味道。氨基酸可以呈现酸、甜、苦、鲜等多种滋味，例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸呈甜味，天冬氨酸、甲硫氨酸和谷氨酸呈鲜味，亮氨酸、苯丙氨酸呈苦味。鲜味氨基酸共同的基本骨架结构为-O-(Cn)-O-(n=3～9)；当n=4～6时，鲜味最强[25]。采用复合蛋白酶和风味蛋白酶分步酶解鸡肉蛋白，酶解物中氨基酸含量较高的为谷氨酸(243.08 mg/g)，其次为天冬氨酸，这是鸡肉酶解液产生鲜味的重要原因[26]。而利用风味蛋白酶和中性蛋白酶分步酶解制备的鸡肉酶解物中含量最高的氨基酸为5种呈苦味的氨基酸，包括亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、缬氨酸和赖氨酸，呈鲜味的谷氨酸居第六位(285.28 μg/mL)。

源自蛋白水解的肽可以赋予味道，例如，谷氨酰肽赋予鲜味，而含有脯氨酸的疏水肽赋予苦味。肽的功能与其分子量密切相关，1000～5000 Da之间的肽可有效提升产品风味[27]。有报道显示鸡肉酶解液中2000～5000 Da的肽是鸡肉呈现浓郁香味的原因[28]。相对分子量较小的肽作为肉的风味前体物质易产生更多的挥发性化合物。

风味核苷酸主要包括5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)和5′-鸟苷一磷酸(5′-GMP)，它们对谷氨酸的鲜味有强化作用[29]。禽肉中的鲜味核苷酸主要产生于肌肉中ATP的降解，5′-IMP在肉类中含量更高，5′-GMP在植物性食物中含量更高[30]。鸡肉酶解液中检测到5′-IMP和5′-GMP的含量高达74.73 μg/mL，可作为很好的风味增强物质。5′-IMP与多肽之间存在复杂的相互作用，从鸡肉酶解物中合成的多肽中，EV、EE呈现淡鲜味，但当它们与5′-IMP混合时，鲜味增强，其他二肽或三肽本身并没有鲜味，但与0.02%的5′-IMP混合时，也呈现出鲜味[31]。

除呈味氨基酸、肽和核苷酸外，在禽类酶解液中还鉴定出了多种挥发性风味物质。例如鸭骨酶解液中主要含醛类、酮类、酯类、烃类、呋喃类化合物[32]。研究显示，酯类可以提高并改善肉香味，呋喃类化合物不仅可以对肉香味起到一定的修饰作用，还会生成如2-甲基-3-呋喃硫醇等肉香味物质的重要中间产物[33]。

在禽肉酶解过程中，上述风味物质的种类和含量发生动态变化，并影响酶解物的风味。Kong等在鸡肉蛋白酶解物中共发现了17种氨基酸，其中苦味氨基酸含量为2819.78 μg/mL，占70.28%；乳酸和琥珀酸含量高达6.75 mg/mL和1.76 mg/mL；与其他核苷酸相比，5′-IMP对鲜味的贡献显著，含量达57.70 μg/mL，这些风味物质对鸡肉酶解液的整体风味作出了重要贡献。以复合蛋白酶和风味蛋白酶分步酶解制备的鸡肉蛋白水解液中谷氨酸、丙氨酸、精氨酸和亮氨酸的含量均较高(>200 mg/dL)；呈味核苷酸二钠含量达到了110.71 mg/dL；酶解产物中的小肽(相对分子质量<1000 u)占比99.85%，有利于热反应调味品的制备。但是这些风味物质之间的相互作用以及影响酶解物风味的关键呈味物质尚不清楚。

3 呈味肽的分离纯化与鉴定

呈味肽是指从食物中提取或由氨基酸合成的对食品风味有一定贡献的低聚肽(分子量<3000 Da)。不同链长和结构序列以及不同氨基酸组成的呈味肽具有不同的呈味特征，呈味肽包括甜味、酸味、咸味、苦味和鲜味5种味感。苦味来源于肽中如精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸和甘氨酸等疏水性氨基酸，氨基酸疏水性基团裸露在肽链表面与苦味受体结合可产生苦味；酸味和咸味主要是由于存在带电荷的末端和/或带电荷的侧链，酸味通常与鲜味有关，鉴定出的二肽VE、AD等同时具有鲜味和酸味特性(见表2)；鲜味肽中的大多数氨基酸序列中含有酸性氨基酸谷氨酸或天冬氨酸，它们对鸡肉酶解物鲜味的产生起到了关键性的影响；此外，呈味肽可以赋予食物厚度、口感和丰富的味道，这种味道被称为“kokumi”，其特点是味道增强、复杂且持久[34]。呈味肽兼具营养价值和呈味功能，是高档复合调味料的重要基料。

呈味肽分离纯化的方法主要包括超滤、凝胶过滤色谱以及反向高效液相色谱等，多是两种及两种以上方法联合使用。目前国内外已从鸡肉酶解物中鉴定出多种呈味肽(见表2)，而鸭肉、鹅肉和禽骨酶解物中的呈味肽鲜有报道。鉴定出的呈味肽中，AM已被报道呈苦味[35]；VE、AEA、ED和AE具有鲜味[36-38]。从鸡肉酶解物中鉴定出的3种肽(WVNEEDHL、NSLEGEFKG和KDLFDPVIQD)，由其序列可知，肽中含有带正电的碱性基团、带负电的酸性基团(-Glu-Glu-Asp-)以及疏水基团，它们的协同作用使得肽段呈现出酸味、甜味和鲜味，并且这3种肽均能显著增强鸡肉粉溶液的肉味、鲜味和厚度[39]。

表2 禽类蛋白酶解物中鉴定的呈味肽

4 结语与展望

采用酶法水解禽类蛋白是开发营养、健康、风味天然、鲜美浓郁的高品质呈味基料的有效途径。目前国内外学者对酶解禽类蛋白制备呈味基料已开展了大量研究，主要集中于酶解鸡肉的工艺优化，酶解过程中呈味物质的变化规律，鸡肉酶解物中呈味肽的鉴定。未来在以下几个方面值得深入研究：禽骨或禽骨与禽肉复合酶解物的呈味特点；探索辅助酶解技术在制备呈味基料中的应用及机理；研究酶解制备呈味基料的风味形成机制，风味物质之间的交互作用，明确关键风味物质并进行定向调控；进一步发掘禽类蛋白酶解物中的鲜味肽。对禽类蛋白酶解物呈味的研究将促进我国调味品行业的高质量发展，且对实现禽类骨架的高值化利用以及禽肉加工业的可持续发展具有重要意义。