脂肪源性干细胞在小鼠膝关节骨关节炎中的作用研究

白 冰，孙铭霞

(河北省承德市中心医院骨科，河北 承德 067000)

传统上，骨关节炎(OA)被认为是作为关节软骨的逐渐磨损和撕裂。然而，最近的证据表明它是整个滑膜关节的炎症性疾病，不仅包括机械退化关节软骨，但也伴随结构和整个关节的功能变化，包括滑膜、半月板(膝部)、关节周围韧带和软骨下骨[1]。膝关节骨关节炎(KOA)是导致老年人残疾的最常见的退行性疾病之一。流行病学研究表明，大约30%的成年人有OA的放射学迹象；8.9%的成年人有临床意义的膝关节OA。另一项研究还表明，OA的可能性随着年龄的增长而增加。中国的一项全国人口研究显示，症状性KOA的总发病率为8.1%，并且KOA的患病率随着年龄的增长而增加。KOA的治疗可分为非手术治疗或手术治疗。非手术治疗包括非药物治疗和药物治疗，非药物治疗包括所有OA患者的核心一线治疗，包括教育、自我管理、运动和减肥。KOA的其他主要非药物治疗包括手杖和生物力学干预措施。药物治疗可能包括使用扑热息痛、局部或口服非甾体抗炎药(NSAID)或关节内皮质类固醇。外科手术是终末期KOA的最后手段，其中最有效的类型是全膝关节置换术和康复治疗。由于OA病理过程得到了很好的描述，其中包括功能性软骨细胞的丧失，几种基于细胞的治疗方法已经成功开发包括骨髓刺激、自体骨软骨移植物或同种异体移植物的植入(ACI)，和移植扩增的自体软骨细胞或扩增的间充质干细胞(MSC)，均有助于恢复关节软骨。滑液中关节内注射MSC一直是主要的基于细胞的方法，已经证明了临床有效性，并探索了再生和免疫抑制活性[2]。由于其非凡的治疗能力，它仍然是研究和临床开发的重要途径。然而，多能MSC直接分化为软骨细胞谱系的细胞导致了多种实验策略来研究组织特异性MSC是否优先用于关节软骨的再生和维持。长期耐久性、增加的组织整合和比活性首先取决于更好的移植存活率和对恶劣环境的更好适应，这仍然是一个挑战。迄今为止，尚缺乏供体样本用于治疗和修复退行性关节的MSC方面更有效。皮下脂肪组织是最容易获得的来源。然而，在关节置换假体实施后，通常切除髌上和髌下脂肪垫，构成合适的自体脂肪组织来源的MSC，称之为脂肪源性干细胞(ASC)。髌下脂肪垫或Hoffa脂肪垫是一种囊内但位于滑膜外的结构，位于膝关节髌骨下方、髌腱、股骨髁和胫骨平台之间。髌上脂肪垫或股四头肌脂肪垫位于关节囊和滑膜之间，排列在关节腔内，呈三角形并延伸穿过髌骨底部。研究已经表明，源自OA模型中髌下垫的ASC的潜在再生能力[3]，与从皮下脂肪组织中获得的细胞相比，免疫表型阳性基质细胞的百分比更高。然而，尚缺乏关于髌上组织再生能力的数据报道。此外，最近的报道还关注了Hoffa衍生细胞的作用，如炎症细胞释放或诱导释放炎症介质，表明髌下脂肪垫在KOA的发生和发展属于活跃的连接组织[4～6]。脂肪源性干细胞(ASC)移植已被证明可以恢复退化的软骨。本研究旨在探讨髌上源性ASC自体移植对小鼠KOA模型中膝关节炎症和软骨退行性等级的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1ASC的分离及培养:该研究纳入了24名年龄在50至80岁之间且需要完全关节置换的患者。本试验已得到承德市中心医院伦理委员会的批准，且患者均知情同意。留取外周血并分离血清。分离髌上或髌下区域的脂肪组织并存放至4℃无菌溶液中的密封容器中。脂肪组织在PBS和抗生素中多次洗涤以清洁组织并去除残留的血液，每10g脂肪组织放置于含有溶液的培养皿中，溶液中含有PBS、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素、IA型胶原酶(0.07%，Sigma C9891 CA，美国)和中性蛋白酶I(0.2mM，Sigma)。使用无菌手术剪将组织切成小块，移至密闭细胞烧瓶中并在37℃、20% O2、5% CO2的振荡器中消化过夜。第2天，收集消化的脂肪组织，并用PBS和抗生素洗涤多次。细胞分为两组，在含10%人血清的培养基或10%胎牛血清中生长(DMEM中含有2mM L-谷氨酰胺、30% Lglucose、100U/mL的青霉素和100ug/mL的链霉素)，孵育过夜。第2天，除去培养基并用新鲜培养基替换，使附着的细胞生长至接近融合，然后进行细胞分化测定。

1.2ASC增殖分析:在每个样品(髌上和髌下)的第3代，在10%人血清或10%胎牛血清培养基存在下，将104个细胞接种在24孔板中。

1.3ASC定向分化:第4代或之后的ASC进行定向分化、诱导脂肪生成、成骨和软骨生成。所有定向分化培养基均来自Lonza(Lonza Co.，Switzerland)。

1.3.1脂肪细胞生成ASC:以10,000个细胞/cm2的细胞密度接种，当ASC融合>90%时，将生长培养基替换为含有胰岛素、地塞米松、IBMX(3-异丁基-甲基-黄嘌呤)和吲哚美辛的分化培养基(脂肪干细胞基础培养基；Lonza Co.)。然后将细胞在标准细胞培养条件下孵育12d。经油红O染色法鉴定脂肪形成。

1.3.2成骨ASC:以10,000个细胞/cm2的细胞密度接种在含有0.1uM地塞米松、50uM Asc2P和10mMμ-甘油磷酸(成骨基础培养基；Lonza Co.)及10%人血清。ASC培养物在该培养基中维持4周(每3天更换一次培养基)。经茜素红染色法鉴定成骨形成。

1.3.3软骨形成在存在:TGF-β1和3(10ng/mL)、ASC的情况下，从最小体积(1×105个细胞/100μL)的高浓度细胞开始，从细胞“Micromass”进行ASC培养2P(50uM)和胰岛素(6.25ug/mL)(Chondro BulletKit;Lonza Co.)4周，培养基每3天更改一次。经阿尔辛蓝染色法鉴定成软骨形成。

1.4OA小鼠模型和细胞移植:12周龄的成年雄性C57BL6小鼠，单次注射含13U胶原酶II的5mM CaCl2溶液6μL，诱导双膝出现严重OA。5d后，当诱发严重软骨损伤的OA时，将所有动物分为4组(每组n=6)。对照组注射生长细胞培养液6μL;含105个细胞的6μL SVF或hASC(来自髌上脂肪垫)分别注射到SVF或hASC组。在PRP组中注射6μL混合富人血小板血浆(PRP)。所有关节内注射均通过使用连接至远程输注/撤回泵11 Elite nanomite可编程注射泵(Harvard Apparatus)的30G Hamilton注射器以6μL/min输注速率进行。PRP是从所有患者的柠檬酸盐管中收集的血液中分离出来的，并按照标准化方法制备。1个月处死所有动物，并收集膝关节。所有动物实验均得到承德市中心医院伦理委员会的批准。小鼠腿在股骨干中部和胫腓骨中部分离并截骨以获得整个关节。大多数附着在膝盖周围的结缔组织，包括肌肉、韧带和肌腱，都被移除，以防止对软骨造成任何损伤。膝盖组织用于组织学分析和定量糖胺聚糖(GAG)。上述过程未发现种属排异反应。为了评估髌上来源的MSC在体外显示的增加的细胞增殖和细胞分化特性是否在软骨再生中具有功能上的有效性，在严重的OA小鼠模型中进行了体内细胞移植试验。对于髌上衍生的人类ASC(hASC)的治疗功效测试，通过在12周龄成年雄性C57BL6小鼠的双膝关节内单次注射胶原酶II (13U)诱发严重OA。小鼠分为对照组、SVF、PRP和hASC组，注射5d后，发生软骨破坏，将105 hASC或SVF或生长培养基(对照)注射到关节内腔内。已经表明，越来越多地在常规临床实践中实施的PRP浸润可以减轻疼痛并改善关节功能，显著改善患者的生活质量[7,8]。因此，还向另一组动物注射PRP，以比较细胞移植与生长因子浸润的再生效果。OA小鼠治疗1周后，膝盖的体积使用自动卡尺测量。

1.5GAG分析:称重膝盖组织，放置于2.5%木瓜蛋白酶溶液，65℃孵育过夜进行消解。将上清液与10% Alcian blue工作溶液孵育，该溶液中包含0.25% Triton X-100的18mM H2SO4，然后与解离溶液(包含4M盐酸胍，0.375 Triton X-100的0.027M H2SO4溶液)孵育30min。将沉淀的GAG悬浮在8M盐酸胍中，并在570nm处定量。平行制作硫酸软骨素标准曲线。

1.6统计学方法:应用SPSS16.0数据处理系统进行数据分析，计量资料以均值±标准差表示。多组间计量资料的比较采用独立样本t检验或单因素方差(one way ANOVA)分析，两组间比较采用SNK-p检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1髌上ASC成骨和软骨形成体外实验:为了进一步评估来自两种脂肪组织来源(髌上脂肪垫和髌下脂肪垫)的干细胞特征，我们比较了两种样品之间的分化多能性。两者都经历了诱导分化成脂肪细胞生成(图1a)、成骨(图1b)和软骨(图1c)生成。然而，分化的程度并不相同。与髌下衍生和髌下分化细胞相比，髌上衍生的ASC显示出更高的成骨和软骨形成潜力(图1)。

图1 髌上和髌下衍生的ASC的脂肪生成、成骨和软骨

2.2髌上源性ASC显着改善KOA小鼠的软骨再生体内实验:如图2(a)所示，OA干预后所有四组的膝关节体积均显著增加。然而，与对照组相比，hASC、SVF和PRP干预组在OA诱导后1个月均显示出这种增加的体积显著减少[图2(a)]。该结果表明治疗具有显著的抗炎作用。然而，当我们通过量化GAG[图2(b)]和OA损伤评分[图2(c)]来检查结构再生效果时，与对照组比较，当动物接受hASC治疗时软骨结构破坏后可再生，OA损伤评分降低。因此，PRP或SVF作为一种有效的抗炎剂，但干细胞的再生作用似乎不受PRP或SVF的影响。

图2 功能性和结构性软骨再生

3 讨 论

基于ASC的疗法已经进行了安全性和有效性阶段的测试[9]。然而，组织特异性干细胞将保证ASC修复能力的提高，例如提高软骨修复的软骨形成效率。在膝关节中，有两个主要的ASC来源，即髌上脂肪垫和髌下脂肪垫。两个脂肪垫通常在急性OA患者的膝关节置换术期间切除，并且是ASC的合适来源，用于其他受影响关节的自体治疗。我们首次展示了OA小鼠模型中髌上源性ASC群体的再生能力。髌下垫衍生细胞被认为是膝关节OA发生和发展过程中的活跃关节组织，通过产生影响软骨和滑膜代谢的炎症介质来激活炎症细胞。当我们在体外比较两种衍生ASC的分化特性时，本研究显示髌上衍生ASC的软骨形成和成骨率有所提高，可有效解决关节退化的细胞治疗[10]。这种差异的多能性使髌上脂肪垫成为软骨组织修复的有希望的细胞来源。

本研究比较SVF和PRP治疗动物的软骨再生效率。有趣的是，治疗组均表现出膝关节体积显著减小。PRP含有多种生长因子，包括TGF-β、PDGF、IGF、bFGF、VEGF和EGF，具有合成代谢软骨促进和软骨保护特性[11]。大量的临床前和临床研究结果支持PRP是一种很有前途的软骨修复和缓解症状的辅助治疗方法，因为它对驻留细胞有合成代谢作用，并且具有抑制炎症和缓解OA症状的潜力，并且具有临床可接受的安全性[12]。PRP治疗在骨缺损等其他相关组织的再生中显示出额外的优势，表明PRP通过影响局部组织微环境，增强祖细胞募集和适当的基质沉积而发挥着至关重要的作用[13]。小鼠模型中，化学诱导的OA导致侵袭性关节退化。然而，即使在如此严重的情况下，ASC移植也降低了OA损伤评分并增加了软骨样组织，改变并挽救了关节内空间的功能解剖结构，为KOA的临床研究提供了新的理论依据。