响应面法优化常压蒸馏提取迷迭香精油工艺

严文芳，高新华，杨锐铣，赵兴文，罗红伟，李正祥，杨海英

(1.大理农林职业技术学院 工程学院,云南 大理 671003；2.云南民族大学化学与环境学院，昆明 650500)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)属唇形科迷迭香属多年生灌木植物，叶片气味芳香，清新宜人，具有桉叶油素和樟脑余韵，略带苦味，原产于地中海地区，是一种传统的药食同源植物[1]。云南香料植物种类较多，其中迷迭香生长良好。从迷迭香叶片中提取的挥发性物质迷迭香精油用途广泛，具有抗肿瘤、抑菌、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗抑郁、预防皮肤疾病等作用[2-6]，迷迭香提取物对鲈鱼调味去腥效果明显[7]。近年来，迷迭香精油作为一种天然活性物质，由于具有良好的抑菌性和抗氧化活性在食品添加、食品保鲜、医药保健、化妆品行业中应用越来越多[8-10]。

目前国内迷迭香精油提取方法常用的有微波辅助水蒸气蒸馏法、超声辅助水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法、超临界CO2萃取法、酶法辅助提取法等[11-14]，上述方法多为从干燥后叶片中提取精油，目前“种植基地+工厂”的生产模式已经可以很好地支持直接从新鲜迷迭香叶片中提取精油的加工方式，陈亮等[15]的研究中提出新鲜迷迭香叶片提取的精油中所含成分多于干燥后的迷迭香叶片。在此研究背景下，课题组选用大理本地生长的马鞭草酮迷迭香品种，以新鲜嫩枝条作为实验原料，每次用枝剪剪取约25 cm长短的鲜叶20 kg用于蒸馏提取精油，进行工艺优化实验。本研究采用常压蒸馏法从新鲜叶片中提取精油，通过测定鲜叶的水分含量，控制蒸馏速度，分液时在馏液中添加固体NaCl改善分液效果，控制预加热时间等可能影响精油出油率的工艺条件，得到基础数据后采用响应面法优化，进而得出常压蒸馏法提取迷迭香精油的最佳工艺条件。

1 材料和方法

1.1 材料

新鲜迷迭香嫩枝：大理本地生长的马鞭草酮迷迭香品种，2～3年生苗木，开紫色小花，课题组根据实验需要采摘嫩枝条用于研究。

1.2 试剂

氯化钠(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器与设备

FA2004N电子天平 上海菁海仪器有限公司；AR2202CN电子天平 奥豪斯仪器(常州)有限公司；PHS-2F型酸度计 上海虹益仪器仪表有限公司；阿贝折光计 上海精密仪器仪表有限公司；X300恒温平台 深圳市鑫豪迈电子科技有限公司；ZNHW数显电热套 上海力辰邦西仪器科技有限公司；DHS-10A水分测定仪 上海仪昕科学仪器有限公司；DHG-9240A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 加热仪器选择

课题组分别采用恒温平台和加热套进行迷迭香精油蒸馏提取实验，通过对比实验，发现采用加热套蒸馏不利于观察，会造成物料焦糊，不易清洁；采用恒温平台的优点是利于观察，方便调温控制蒸馏速度，故选恒温平台作为加热仪器。

1.4.2 加热容器选择

课题组分别采用圆底烧瓶和三角烧瓶进行迷迭香精油蒸馏提取实验，通过对比，圆底烧瓶由于烧瓶口小，装填物料耗时长，蒸馏结束取出残渣困难；三角烧瓶利于装填物料和取出蒸馏残渣，节约时间。故选三角烧瓶作为加热仪器。

1.4.3 蒸馏提取工艺条件选择[16-21]

称取混匀的1 kg迷迭香嫩枝条剪成约2 cm长，料液比(迷迭香∶纯水)为1∶1，并测定采摘的迷迭香嫩枝条在第1,3,7天的水分。

1.4.3.1 控制蒸馏速度实验

同一水分的迷迭香嫩枝，课题组从蒸馏速度的因素出发，分别控制蒸馏速度为1，2，3 滴/s，蒸馏时间为5.0，3.0，2.0 h，蒸馏结束后用1000 mL分液漏斗进行分液，所得上层液体为迷迭香精油，淡黄色，有特有的马鞭草酮迷迭香精油的香气，称量提取所得精油质量(g)，计算精油提取率(%)和精油提取率(以干物质计，%)，测定下层溶液迷迭香纯露pH，纯露pH为4.60～4.61，测定精油折光率为1.4706，实验数据见表1。

表1 控制蒸馏速度提取迷迭香精油实验数据

由表1可知，迷迭香嫩枝条水分从第1天到第3天下降了9.92 g/100 g，以第3天到第7天水分下降了2.09 g/100 g。实验中蒸馏速度控制为1 滴/s时，精油提取率为1.14%～1.61%，精油提取率(以干物质计)为4.29%～4.63%；蒸馏速度控制为2 滴/s时，精油提取率为1.16%～1.61%，精油提取率(以干物质计)为4.29%～4.65%；蒸馏速度控制为3滴/s时，精油提取率为1.01%～1.41%，精油提取率(以干物质计)为3.82%～4.08%。从精油提取率的高低可以看出，控制蒸馏速度为2 滴/s和1 滴/s时，精油提取率相对较高，用时分别为3 h和5 h。

1.4.3.2 萃取分液时添加NaCl实验

迷迭香精油分离提取时，课题组使用分液漏斗静置分层，精油和纯露分层不明显，影响分液。为更好地进行油水分离提高精油提取率，课题组重新采样，测定迷迭香嫩枝在第1天水分为75.22%，1 kg新鲜迷迭香叶片中加入1 L纯水(料液比为1∶1)，控制蒸馏速度为2滴/s，蒸馏3组，蒸馏结束时，馏液体积约为500 mL，在分液漏斗中分别加入2.5，5.0，7.5 g固体NaCl，观察记录分液漏斗静置时的现象，记录所提取精油和纯露的体积(mL)，称量提取精油的质量(g)，计算精油提取率(%)，测定分离后下层溶液迷迭香纯露pH值，纯露pH为4.60～4.61，加入氯化钠前、后pH值无变化，测定20 ℃时精油折光率为1.4707，20 ℃时精油密度为0.8947，实验数据见表2。

表2 精油提取时添加固体NaCl实验数据

由表2可知，在精油提取静置分层时每500 mL馏液中加入2.5 g固体NaCl(添加量为0.5 g/dL)时，分层较不添加明显；当加入5.0 g固体NaCl(添加量为1.0 g/dL)时，分层明显；当加入7.5 g固体NaCl(添加量为1.5 g/dL)时，分层明显。在馏液中添加固体NaCl，可以提高精油提取率。当添加量为0.5 g/dL时，精油提取率相对提高3.03%；添加量为1.0 g/dL时和添加量为1.5 g/dL时，精油提取率相对提高了4.24%和4.33%。从实验数据得出馏液中固体NaCl添加量为1.0 g/dL可达到分层明显的效果。

1.4.3.3 预加热实验

考虑到迷迭香精油成分复杂且含多种有效化合物成分[22]，由于各组分沸点不同，课题组重新采样，测定迷迭香嫩枝在第1天水分为75.20%，1 kg迷迭香鲜叶加入1 L纯水(料液比为1∶1)，在蒸馏时加热至沸腾后保持微沸状态，时间分别为20，30，40 min后继续蒸馏，控制蒸馏速度为2 滴/s， 蒸馏结束后加入5.0 g固体NaCl，静置分层30 min，萃取分液。量取精油体积(mL)，称量精油质量(g)，计算精油提取率(%)，计算精油密度，测定精油折光率，测定下层液体迷迭香纯露pH，纯露pH为4.60～4.61，20 ℃时精油折光率为1.4706，20 ℃时精油密度为0.8946，实验数据见表3。

表3 精油提取时预加热实验数据

由表3可知，预加热20 min时迷迭香精油提取率相对提高了9.92%，预加热30 min和40 min时，精油提取率相对提高了11.57%，常压蒸馏时进行预加热30 min可以使精油提取率相对提高10%以上。

1.4.4 响应面优化实验

根据迷迭香精油常压蒸馏提取工艺条件选择实验结果，选择刚采摘1 d的迷迭香嫩枝，水分含量在75.17%～75.22%，选取了蒸馏速度、NaCl添加量和预加热时间3个可能对精油提取率影响较大的因素，设计Box-Behnken实验，响应面实验因素和水平见表4。

表4 响应面实验因素与水平

2 结果与分析

2.1 响应面实验设计[23-27]

应用Design Expert软件进行响应面实验设计，见表5。

表5 响应面实验设计

对响应面实验设计进行软件分析拟合，得到残差诊断图、模型统计方差分析表和模型等高线、响应面图。

2.2 残差诊断图和模型统计方差分析

2.2.1 残差正态概率图和残差与运行顺序图

由分析软件Diagnostics菜单得到正常的残差正态概率图和残差与运行顺序图，见图1。

图1 残差正态概率图和残差与运行顺序图

由图1可知，17个实验点的标准化残差均落在(-2，2)区间，在95%置信度为正常的实验点，均参与回归直线拟合。从残差与运行图中17个实验点的分布趋势判断，实验设计呈近似正态分布，所拟合的线性模型满足相关假设，模型设计正确[28]。

2.2.2 响应面实验回归模型方差分析

使用软件进行响应面回归模型的方差分析，得到精油提取率方差分析表，见表6。

表6 回归模型方差分析

由表6可知，回归模型的P<0.0001，极显著，而失拟项的P=0.2813>0.05，不显著。此外，模型的F值为113.44，表明该模型是显著的，该模型拟合程度良好，可用来分析响应值与因素值的关系及变化情况。由表6中F值的大小可知，3个实验因素对迷迭香精油提取率的影响大小排序是A(蒸馏速度)>C(预加热时间)>B(NaCl添加量)。

P值<0.0500表明模型项是显著的。由表6可知，A、B、C、A2、B2、C2是重要的模型项；而AB、AC、BC对精油不显著(P>0.05)。

2.2.3 二次回归方程分析

对表5中实验数据进行二次多项回归拟合，获得精油提取率对中蒸馏速度(A)、NaCl添加量(B)、预加热时间(C)的多元回归方程为：精油提取率=0.98+0.2025A+0.1125B+0.011125C-0.01AB-5.0E-004AC+5.0E-004BC-0.06375A2-0.045B2-1.625E-004C2。

模型的二项式拟合相关系数R2=0.9932，表明该模型拟合程度良好。模型的修正相关系数RAdj2=0.9844，说明预测值和实测值基本吻合，预测性良好[29-31]。

2.2.4 等高线和响应面分析

蒸馏速度与NaCl添加量、蒸馏速度与预加热时间、NaCl添加量与预加热时间这3组因素间有交互作用，对其进行响应面分析，探究它们之间的具体交互规律。回归模型获得的等高线图和响应曲面图见图2～图4。

图2 蒸馏速度和NaCl添加量对精油提取率影响的等高线和响应面

图3 蒸馏速度和预加热时间对精油提取率影响的等高线和响应面

图4 NaCl添加量和预加热时间对精油提取率影响的等高线和响应面

由图2～图4可知，等高线呈椭圆形，3个响应因素在相对应的实验范围内都有响应极值，且3组因素的交互作用结果与方差分析结果一致。通过对各响应因素交互作用对精油提取率影响的响应面及等高线图进行分析，并结合软件计算回归模型可以预测出迷迭香精油的最佳提取工艺条件为蒸馏速度2 滴/s，预加热时间30 min，蒸馏液以1.0 g/dL添加固体NaCl，将三因素代入回归方程计算得出精油提取率为1.35%，当新鲜嫩枝水分为75.20%时，精油提取率(以干物质计)可达5.44%。

2.3 最佳工艺条件实验验证

为验证回归模型的预测值与实验真实值之间的拟合程度，采用精油提取率最大值对响应因素进行验证。选定蒸馏速度2 滴/s，预加热时间30 min，蒸馏液以1.0 g/dL添加固体NaCl，其他条件不变，进行3组平行实验，测定迷迭香嫩枝水分为75.22%，精油平均提取率为1.347%，精油提取率(以干物质计)可达5.44%。此实验值与回归模型精油提取率预测值(1.35%)相对误差为0.22%。因此，通过响应面法优化得到的常压蒸馏提取精油最佳工艺条件的回归模型是符合实际的，对今后常压蒸馏迷迭香提取精油工艺参数选择具有一定指导意义。

3 结论

实验数据和分析结果表明，通过响应面法优化后的常压蒸馏法提取迷迭香精油的工艺较稳定，方法简便易掌握，成本低而提取率较优化前有显著提高。常压蒸馏法提取的迷迭香精油无溶剂残留等污染，精油纯度高，折光率为1.4706～1.4707，密度为0.8946～0.8947，化学成分种类多，质量好，是一种较理想的食品添加剂。根据响应面法优化常压蒸馏法提取鲜叶迷迭香精油工艺实验结果表明，当采用新鲜的迷迭香嫩枝，水分含量为75.17%～75.22%，剪碎至2 cm大小，1 kg迷迭香鲜叶中加入纯水1 L，料液比为1∶1时，常压蒸馏法提取迷迭香精油的最佳工艺条件为：控制蒸馏速度2 滴/s，蒸馏时预加热30 min，蒸馏液以1.0 g/dL添加固体NaCl，迷迭香精油提取率可达1.35%，精油提取率(以干物质计)可达5.44%。本研究实验的过程与方法对相关研究具有一定的参考价值，可为常压蒸馏提取迷迭香等香料植物精油提供一定的工艺参考。