基于p38MAPK通路探讨益气利湿汤对阿霉素致慢性肾小球肾炎大鼠的干预作用

李 莹，张春戬，杨 磊，刘晓艳，尚 靖，郑佳新

(黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis,CGN)以双侧肾小球不同程度的炎性病变为主要病理变化，以蛋白尿、血尿、水肿、高血压为主要临床表现，其病程长、易复发[1-2]。CGN患者若得不到及时有效的治疗，长期存在的蛋白尿可通过介导炎症介质、细胞因子等对肾小球和肾小管造成持续性损害，引起不同程度的肾功能减退甚至肾脏纤维化，最终导致终末期肾衰竭[3-5]。CGN的全球发病率约为13.4%，而我国的患病率约为10.8%，且随着高血压、糖尿病、肥胖及代谢综合征等疾病发病率的升高，CGN的发病率逐年增高[6]。相关统计显示，CGN已经成为引起慢性肾衰竭的首要疾病，其导致的慢性肾衰竭约占其总数的64.1%[1，7]。益气利湿汤是治疗肾病的临床经验方，临床研究证实其可以明显改善慢性肾炎患者的血尿、蛋白尿及临床症状[8]，实验研究证实其可通过影响血管内皮生长因子-A(VEGF-A)/血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)信号通路起到减轻阿霉素肾病大鼠蛋白尿的作用[9]，但其具体作用机制尚未明确。本实验基于p38MAPK信号通路，旨在进一步探讨益气利湿汤治疗CGN的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雄性SD大鼠50只，体重(200±20)g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2020-0002。饲养环境：温度(22±2)℃，湿度(50±10)%，照明时间12 h/d。本实验相关操作经黑龙江省中医药科学院伦理委员会批准进行(SY3R-2022028)。

1.2实验药物 益气利湿汤，组方：黄芪20 g、党参20 g、芡实20 g、车前子15 g、黄芩15 g、半枝莲20 g、鱼腥草20 g、白花蛇舌草20 g、柴胡15 g、地骨皮15 g、麦冬15 g、茯苓15 g、僵蚕20 g，购自黑龙江省中医药科学院。药物加5倍量水煎煮2次，滤过，合并煎煮药液，浓缩至每1 mL含生药3.5 g的浓缩液备用。雷公藤多苷片，浙江得恩德制药股份有限公司，批号：1905121B；阿霉素(注射用盐酸多柔比星)，海正辉瑞制药有限公司，国药准字H33021980。

1.3实验仪器及试剂 深圳雷杜RT-2100C酶标仪，日立LST-003全自动生化仪，奥体BK-DM500光学显微镜，Bio-Rad IQTM5 PCR 仪。尿白蛋白、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血白蛋白(ALB)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒购于南京建成生物工程研究所(货号分别为C035-2-1，C013-2-1，C011-2-1，A028-1-1，A110-2-1，A111-2-1，C009-3-1，C010-3-1)；p38MAPK抗体购于Cell Signaling Technology公司，货号：9212S；转化生长因子-β1(TGF-β1)、β-actin单抗和标记的二抗均购于Abcam公司(货号分别为ab92486，ab8226，ab6721)。

1.4实验方法 大鼠适应性喂养1周后按体重随机分为空白组、模型组、雷公藤组、益气利湿汤中剂量组、益气利湿汤高剂量组，每组10只。空白组大鼠给予生理盐水0.5 mL/只尾静脉注射，其他4组大鼠均给予阿霉素6 mg/kg尾静脉注射。1周后检测24 h尿蛋白定量证实造模成功后，雷公藤组给予雷公藤多苷混悬液0.85 mg/(kg·d)灌胃，益气利湿汤中、高剂量组分别给予益气利湿汤24.15 g/(kg·d)、48.3 g/(kg·d)灌胃，空白组与模型组均给予等量生理盐水灌胃，均1次/d，连续灌胃5周。

1.5检测指标及方法

1.5.1大鼠状态及生化指标 于实验期间密切观察各组大鼠的状态，在末次灌胃之后将大鼠置于代谢笼中24 h留取尿液标本，使用双缩尿比色法测定各组大鼠24 h尿蛋白定量；称取大鼠体重，详细记录一般情况，以10%水合氯醛按3.5 mL/kg的剂量麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心取上清，使用生化分析仪，采用ELISA法测定血清中BUN、SCr、ALB、AST、ALT、TC、TG水平。

1.5.2肾脏组织病理形态 取各组大鼠的肾脏组织，使用多聚甲醛进行固定，之后按照步骤分别进行脱水、包埋及切片后进行HE染色，观察肾脏组织的形态。

1.5.3肾脏组织中TGF-β1及p38MAPK蛋白表达情况 采用Western blot法检测：取适量肾组织剪碎，加入RIPA裂解液，制备匀浆，提取蛋白并使用BCA法测定其蛋白含量。随后依次进行上样、电泳及转膜，在TBST中清洗1 min之后使用5%的脱脂牛奶在室温下封闭1 h，封闭结束后加入稀释过的兔抗鼠单克隆抗体，密封后在4 ℃下孵育过夜。在TBST中清洗3次后加入使用辣根过氧化物酶标记过的羊抗兔二抗，之后在37 ℃下孵育1 h，使用凝胶成像系统显影，读取目的条带灰度值，以目的蛋白灰度值/内参灰度值来表示蛋白的相对表达量。

1.5.4肾脏组织中TGF-β1及p38MAPK mRNA表达情况 采用RT-PCR法检测：取部分肾组织用液氮固定，通过Trizol试剂提取大鼠肾脏组织中的总RNA，具体方法按说明书进行。将提取到的RNA使用氯仿进行处理，4 ℃下离心15 min(10 000 r/min)，使用75%乙醇沉淀，在25 μL的反应体积中对样品的总RNA(2 μg)进行反转录，扩增程序：55 ℃3 min，90 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，66 ℃ 2 min，进行40个循环。使用PCR仪测定荧光信号，将所获得的数据依照公式2-△△Cq计算相对表达量。引物序列：TGF-β1上游引物5’-ATGGTGGACCGCAACAAC-3’，下游引物5’-TGAGCACTGAAGCGAAAGC-3’；p38MAPK上游引物5’-CCGAGCGATACCAGAAC-3’，下游引物5’-CACATCCAACAGACCAATC-3’；β-actin上游引物5’-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3’，下游引物5’-TTCAGGGTCAGGATGCCTCT-3’。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 注射阿霉素后第2天，大鼠尾部出现红肿，食量开始减少，大便偏稀，倦卧，互相畏缩，部分大鼠出现烂尾；实验过程中模型组死亡3只，雷公藤组及益气利湿汤高剂量组各死亡2只，益气利湿汤低剂量组死亡1只。实验结束后，空白组大鼠饮食、二便等一般状态均正常；模型组大鼠消瘦、精神萎靡，大便稀溏；雷公藤组及益气利湿汤中、高剂量组大鼠上述症状较模型组明显减轻。

2.2各组大鼠24 h尿蛋白定量及血清BUN、SCr水平比较 模型组大鼠24 h尿蛋白定量明显高于空白组(P<0.05)；雷公藤组及益气利湿汤中、高剂量组大鼠24 h尿蛋白定量均明显低于模型组(P均<0.05)，且雷公藤组及益气利湿汤高剂量组均明显低于益气利湿汤中剂量组(P均<0.05)；各组间血清BUN、SCr水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 空白组和慢性肾小球肾炎各组大鼠24 h尿蛋白定量及血清BUN、SCr水平比较

2.3各组大鼠肝功能及血脂指标比较 与空白组比较，雷公藤组大鼠血清ALT、AST水平均明显升高(P均<0.05)，模型组和益气利湿汤中、高剂量组均无明显变化(P均>0.05)；模型组大鼠血清ALB水平明显降低(P<0.05)，血清TC、TG水平均明显升高(P均<0.05)。与模型组比较，雷公藤组及益气利湿汤中、高剂量组大鼠血清ALB水平均明显升高(P均<0.05)，血清TC、TG水平均明显降低(P均<0.05)。与益气利湿汤中剂量组比较，雷公藤组和益气利湿汤高剂量组大鼠血清ALB水平均更高(P均<0.05)，血清TC、TG水平均更低(P均<0.05) 。见表2。

表2 空白组和慢性肾小球肾炎各组大鼠血清肝功能指标及血脂指标水平比较

2.4各组大鼠肾脏组织病理学表现 空白组大鼠肾单位饱满无间隙，肾小球内可见少量红细胞，肾小管内细胞丰富且排列规整；模型组大鼠的肾小管上皮细胞可见空泡样变性，间质内可见局灶性炎性细胞浸润及大量蛋白管型，并伴有纤维组织增生性改变；与模型组相比，雷公藤组及益气利湿汤中、高剂量组大鼠上皮细胞空泡变性程度较轻，炎性细胞浸润和蛋白管型减少，且均无纤维组织增生性改变，其中雷公藤组病变程度最轻。见图1。

2.5各组大鼠肾组织中TGF-β1、p38MAPK表达情况 模型组大鼠肾组织中TGF-β1、p38MAPK蛋白及mRNA相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05)；雷公藤组及益气利湿汤中、高剂量组大鼠肾组织中TGF-β1、p38MAPK蛋白及mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，且雷公藤组及益气利湿汤高剂量组均明显低于益气利湿汤中剂量组(P均<0.05)。见图2及表3、表4。

表3 空白组和慢性肾小球肾炎各组大鼠肾脏组织中TGF-β1、p38MAPK蛋白相对表达量比较

表4 空白组和慢性肾小球肾炎各组大鼠肾脏组织中TGF-β1、p38MAPK mRNA相对表达量比较

3 讨 论

免疫机制是肾小球疾病的始发机制，而炎症介质的参与则在此基础上促进了肾小球疾病的发生及进展[10]。多条炎症相关信号通路相互影响、相互作用，共同参与了肾脏组织的炎症反应，其中包括占据重要地位的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及核因子-κB ( NF-κB)[11-12]。TGF-β1、血小板源性生长因子(PDGF)及白细胞介素等还能够激发下游信号通路并将信号转导至细胞核内，进而对核内相应靶基因的转录或表达进行调控，最终产生炎症效应[13]。

作为MAPK家族的重要成员之一，p38MAPK信号通路能转导多种细胞外信号，尤其会在氧化应激环境中产生大量包括炎症细胞、炎症因子在内的炎症介质，从而引起肾脏的足细胞凋亡及基质沉积等病理效应。在肾小球疾病的发生过程中，p38MAPK信号通路可以被氧化应激、前炎症因子及高血糖等多种因素诱导而激活，接着通过激活下游炎症细胞、诱导炎症介质表达及产生细胞因子等途径导致足细胞损伤[14]。TGF-β1与p38MAPK密切相关，相互影响，TGF-β1能够以p38MAPK的上游启动因子的身份存在，从而激活p38MAPK，也可以作为p38MAPK的下游产物而引发炎症反应。TGF-β1介导的p38MAPK信号通路与CGN病程进展过程密切相关，并在其中起关键作用[15]。p38MAPK的过度激活导致其下游产物相应增多进而导致炎症反应、细胞凋亡并且损伤肾脏组织，且该通路可以与其他相关通路协同作用，进一步加重肾脏损伤；另外，p38MAPK可以通过对TGF-β1、NF-κB等因子表达的调控影响肾间质纤维化的进展，是肾脏纤维化的一条经典途径[16]。

益气利湿汤是王铁良教授治疗肾病的经验方剂，方中黄芪、党参补气升阳，脾肺同调，可同时助脾运化、助肺行水，并且现代药理研究表明此二味中药可以增强机体的免疫功能[17-18]；芡实补益脾肾，与芪、参相合脾肾同补，使得先后天相互滋养；茯苓淡渗利湿，与参、芪相配更增利水之能；黄芩清上焦心肺之热，肺热清则清肃下行，心火清则心肾相交；地骨皮、麦冬有滋阴清热之功，地骨皮还具有调节免疫及降低血糖、血压、胆固醇的作用[19]；车前子通利水道，渗湿泄热；僵蚕祛风通络；柴胡疏肝理气，兼以和解少阳；另外酌加半枝莲、白花蛇舌草、鱼腥草等防其热化。此方补气与养阴并重，兼以清热利湿，诸药相配, 相辅相成，使得诸邪得去、诸证得解。

本实验通过对TGF-β1/p38MAPK表达水平的检测探索其是否为益气利湿汤治疗CGN的作用靶点，结果显示益气利湿汤可以显著降低阿霉素致CGN大鼠的24 h尿蛋白定量及血清TC、TG，升高血清ALB，可有效减轻肾脏病理学改变，减少炎性细胞浸润及蛋白管型的数量，其机制可能与调控TGF-β1/p38MAPK信号通路进而抑制炎症反应损伤有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。