黄夏白冬消癌汤对Lewis肺癌小鼠Bax/ Bcl-2/Caspase-3信号通路的影响

刘 利，周佩夏，边 娜，王旭辉，王 坤，赵国静，胡海波，陆学超

(1. 山东中医药大学，山东 济南 250014；2. 青岛市中医医院，山东 青岛 266033)

肺癌是发病率和病死率极高的恶性肿瘤之一,且多数患者确诊时就处于Ⅲ期或Ⅳ期，无法接受手术治疗[1-2]。化疗是肺癌患者，尤其是晚期肺癌患者综合治疗主要手段之一，顺铂是一线化疗药物，其通过与目标DNA结合改变其结构方式阻止目标DNA复制，导致肺癌细胞凋亡[3]。然而，化疗药物缺乏特异性，在其杀伤肿瘤细胞的同时也会损害人体正常的细胞，影响消化、神经、免疫等系统，引发各种不良反应[4]。多项研究证实，中医药在肿瘤的治疗中发挥着积极作用，其可以通过提高机体免疫功能[5]，减轻炎性反应、改善肿瘤微环境[6]，抑制肿瘤细胞增殖和迁移等途径遏制肿瘤生长[7]，同时可减轻化疗药物带来的不良反应[8]，改善患者喘憋、疼痛等临床症状，延长生存时间。肿瘤细胞凋亡与增殖的失衡使得肿瘤组织增大、转移，因此促进肿瘤细胞凋亡，抑制、减慢其增殖，是抗肿瘤治疗的重要方向。黄夏白冬消癌汤是临床治疗肺癌的有效方剂，但其作用机制尚不明确。本实验通过建立肺癌荷瘤小鼠模型，以凋亡信号通路Bax/Bcl-2/Caspase-3及NF-κB p65为靶点，探讨了黄夏白冬消癌汤治疗肺癌的分子生物学机制，为其临床应用提供科学依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 40只雄性C57BL/6小鼠，体重18～22 g，购自北京华阜康实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2019-0008。将其饲养于SPF级的动物室内，室温20～24 ℃，相对湿度50%～70%，给予无菌饲料及无菌水，自由饮食。研究经山东中医药大学伦理审核通过(QDU-AEC-2022140)。

1.2瘤株、试剂与仪器 小鼠Lewis肺癌瘤株，中国科学院上海生命科学研究院；RNA提取(货号：DP431)、反转录(货号：KR106-02)、扩增试剂盒(货号：KT109)，天根生物科技有限公司；qPCR试剂(货号：10032048)、PBS磷酸盐缓冲液(货号：1610780)、DAB显色试剂盒(货号：1706535)，美国Bio-Rad公司；兔抗Bax(货号：ab81083)、Bcl-2(货号：ab238042)、Caspase-3 (货号：ab208161)、NF-κB p65(货号：ab76311)抗体，艾博抗贸易有限公司。荧光定量PCR仪，Bio-RAD公司(型号：iQTM5)。

1.3药物 顺铂注射液，齐鲁制药有限公司，批号：8K029A89，规格：10 mg/支。黄夏白冬消癌汤组方：黄芪30 g、防己15 g、川芎15 g、夏枯草30 g、僵蚕15 g、白英15 g、海浮石30 g、麦冬15 g，生药由青岛市中医医院中药房提供。将上述生药放置于清洁容器中，倒入蒸馏水浸泡30 min，水位超过药材2 cm，煎煮40 min，无菌纱布滤出药液，再加蒸馏水同法煎煮，混合2次药液，分别将煎煮药液浓缩至2 g/mL、4 g/mL,分别记为低剂量、高剂量，放置于4 ℃保存备用，保质期为1周。

1.4实验方法 小鼠于动物实验室预饲养1周后进行模型制备：取细胞浓度为1×107/mL的Lewis肺癌细胞悬液，于小鼠右侧腋窝皮下注射0.2 mL，1周后如在小鼠右腋下可触及豆粒大小的肿物即为模型制备成功。然后将荷瘤小鼠随机分为模型组、顺铂组、黄夏白冬消癌汤低剂量组、黄夏白冬消癌汤高剂量组，每组10只。顺铂组给予顺铂2 mg/kg腹腔注射，每2 d 1次，连续注射14 d；黄夏白冬消癌汤低、高剂量组分别给予2 g/mL、4 g/mL黄夏白冬消癌汤0.2 mL灌胃，模型组给予生理盐水0.2 mL灌胃，均1次/d，连续灌胃14 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1肿瘤体积及抑瘤率 分别于干预2，4，6，8，10，12，14 d运用游标卡尺测量各组小鼠肿瘤长径与短径，计算肿瘤体积，计算公式：肿瘤体积=肿瘤长径×肿瘤短径2/2；末次干预结束后脱颈椎处死各组小鼠，剥离皮下瘤体称重，计算抑瘤率，计算公式：抑瘤率=(模型组平均瘤重-药物干预组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%。

1.5.2肿瘤组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleved-Caspase-3蛋白表达情况 采用Western Blot法检测：提取肿瘤组织蛋白，制备蛋白样本。行SDS-PAGE电泳，转膜，洗膜后加入5%脱脂牛奶摇床上封闭2 h，加入稀释倍数均为1∶1 000的一抗，4 ℃震荡孵育过夜。洗膜3遍后加入二抗，在室温条件下孵育2 h，洗涤。化学发光显色成像，通过Image J分析灰度值，并计算p-NF-κB p65/NF-κB p65、Bax/Bcl-2、Cleved-Caspase-3/Caspase-3 比值。

1.5.3肿瘤组织中NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达情况 采用qPCR法检测：取小鼠肿瘤组织，使用PBS溶液清洗后，加入Trizol试剂将其裂解，提取小鼠肿瘤组织中的总RNA，反转录合成cDNA。将cDNA作为模板，按照试剂盒说明分别加入引物(引物序列见表1)和SuperReal PreMix Plus等，扩增反应条件:95 ℃ 15 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，进行40个循环，以β-actin为内参，采用2-△△Ct方法进行相对定量分析。

表1 肺癌组织中NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA检测引物序列

2 结 果

2.1各组荷瘤小鼠肿瘤生长曲线 4组小鼠肿瘤均呈增长态势，模型组小鼠肿瘤生长迅速。干预6～14 d期间，黄夏白冬消癌汤低剂量组各时间点肿瘤体积虽低于模型组，但2组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；顺铂组及黄夏白冬消癌汤高剂量组肿瘤生长延缓，肿瘤体积均明显低于同期模型组及黄夏白冬消癌汤低剂量组(P均<0.05)，顺铂组与黄夏白冬消癌汤高剂量组各时间点肿瘤体积比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

2.2各组荷瘤小鼠肿瘤增殖抑制率比较 黄夏白冬消癌汤低剂量组小鼠瘤重与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；顺铂组及黄夏白冬消癌汤高剂量组小鼠瘤重均明显低于模型组与黄夏白冬消癌汤低剂量组(P均<0.05)，且抑瘤率均明显高于黄夏白冬消癌汤低剂量组，顺铂组与黄夏白冬消癌汤高剂量组瘤重与抑瘤率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组Lewis肺癌小鼠瘤重及抑瘤率比较

2.3各组荷瘤小鼠肿瘤组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleved-Caspase-3蛋白表达情况 顺铂组及黄夏白冬消癌汤低、高剂量组p-NF-κB p65/NF-κB p65均明显低于模型组(P均<0.05)，Cleved-Caspase-3/Caspase-3 均明显高于模型组(P均<0.05)；顺铂组及黄夏白冬消癌汤高剂量组Bax/Bcl-2明显高于模型组(P均<0.05)，黄夏白冬消癌汤低剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；黄夏白冬消癌汤低、高剂量组p-NF-κB p65/NF-κB p65均明显高于顺铂组(P均<0.05)，Cleved-Caspase-3/Caspase-3均明显低于顺铂组(P均<0.05)；黄夏白冬消癌汤高剂量组Bax/Bcl-2与顺铂组比较差异无统计学意义(P>0.05)，黄夏白冬消癌汤低剂量组明显低于顺铂组(P<0.05)；黄夏白冬消癌汤高剂量组的p-NF-κB p65/NF-κB p65、Bax/Bcl-2均明显高于黄夏白冬消癌汤低剂量组(P均<0.05)，2组Cleved-Caspase-3/Caspase-3比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2及图3。

2.4各组荷瘤小鼠肿瘤组织中NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相对表达量比较 顺铂组及黄夏白冬消癌汤低、高剂量组NF-κB p65、Bcl-2 mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)；顺铂组及黄夏白冬消癌汤高剂量组Bax、Caspase-3 mRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，黄夏白冬消癌汤低剂量组Bax、Caspase-3 mRNA相对表达量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；黄夏白冬消癌汤低、高剂量组Bax、Caspase-3 mRNA相对表达量均明显低于顺铂组(P均<0.05)，Bcl-2 mRNA相对表达量均明显高于顺铂组(P均<0.05)，NF-κB p65mRNA相对表达量与顺铂组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，黄夏白冬消癌汤低、高剂量组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 各组Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相对表达量比较

3 讨 论

中医将“肺癌”归属于“肺积”“息贲”“积聚”“癥瘕”等范畴。关于其核心病机，目前主流学术观点多认为是正虚邪实[9-11]。在肺癌演变过程中，正虚主要以气虚、阴虚、阳虚为主，邪实以痰、瘀、毒(热)为主，因虚致实，因实致虚，恶性循环，终致邪实凝结成癌。因此，中医治疗肺癌应以扶正祛邪为根本治法。黄夏白冬消癌汤正是基于上述认识，结合临床实践组方而成，该方含4个“药对”，其中黄芪、防己归肺经，合用可益气扶正祛水湿；夏枯草、僵蚕配伍可软坚散结、缓消癥瘕；麦冬、海浮石联用可养阴润肺祛顽痰；白英、川芎同用具有理气活血、清热解毒之效。上述8味药物环环相扣，彼此兼顾，相使相佐，可明显改善肺癌患者症状，延缓病情进展。本实验结果显示，黄夏白冬消癌汤高剂量组和顺铂组肿瘤生长延缓，肿瘤体积明显低于模型组，黄夏白冬消癌汤高剂量组肿瘤体积、抑瘤率比较差异不明显，证实黄夏白冬消癌汤可明显抑制Lewis 肺癌小鼠肿瘤生长。

细胞凋亡是机体在生理和病理条件下发生的自主、协调、有序的细胞死亡过程，该过程受多种因素调控，在癌症的发生、发展中扮演着重要角色，与肿瘤的恶化、转移等密切相关。线粒体途径是调控细胞凋亡的主要途径之一，内源性刺激触发线粒体释放细胞色素C等可溶性膜间隙蛋白，激活半胱天冬酶，导致不可逆的细胞快速死亡[12]，而这一过程受到Bcl-2蛋白家族的调控。Bcl-2蛋白家族由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白组成，二者的协调平衡维持着细胞凋亡正常进行[13-14]。Bax与Bcl-2相互拮抗，Bax为促凋亡蛋白，Bcl-2为抗凋亡蛋白，Bcl-2可与Bax形成同源的蛋白二聚体，当Bax表达处于优势地位时，拮抗Bcl-2发挥作用，促使细胞色素C从线粒体释放到细胞质，引发细胞凋亡[15-16]。Caspase家族处于细胞凋亡的下游，是凋亡过程执行任务的主要力量[17]。Caspase-3是Caspase家族的核心激酶，激活后可转化为Cleaved-Caspase-3，直接导致细胞解体[18]。NF-κB是一种核转录因子，在相关因素的刺激下被激活，其活化物主要为NF-κB p50和NF-κB p65，可调控细胞因子、血管生成因子和与肿瘤进展及转移相关的酶等多种基因的表达[19]。有研究表明，NF-κB p65 活化为p-NF-κB p65，可上调下游抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，影响肿瘤细胞的凋亡、侵袭和转移[20-21]。本实验结果显示，黄夏白冬消癌汤、顺铂干预均可显著上调Bax、Caspase-3表达，下调Bcl-2、NF-κB p65表达，抑制NF-κB p65磷酸化，促进Caspase-3活化，启动 Caspase 级联反应，诱导细胞凋亡，且高剂量黄夏白冬消癌汤的作用与顺铂相当。

综上所述，黄夏白冬消癌汤可通过调控Bax/ Bcl-2/Caspase-3信号通路，促进细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，与顺铂或其他癌症治疗方法结合使用可能效果更好。关于黄夏白冬消癌汤在抗癌治疗中的其他作用途径仍需进一步探索。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。