补中益气汤对PTEN/PI3K/Akt/FOXO1通路介导的盆腔脏器脱垂大鼠子宫骶韧带组织胶原代谢的影响

严 晓，高立群，林 艳，许 岚，张忻佩，朱小丹，胡佳贞，樊伯珍

(1. 上海中医药大学附属普陀医院，上海 200062；2. 上海中医药大学，上海 201203)

盆腔脏器脱垂被定义为阴道前壁、阴道后壁、子宫或阴道顶端(子宫切除后的阴道穹隆)中的1个或多个下降并伴有功能障碍或出现不适症状，是中老年女性常见的妇科良性疾病[1]，但会严重影响患者生活质量、心理健康，进而影响社会活动，故也被称为“社交癌”。目前西医对早期盆腔脏器脱垂患者通常采用盆底肌肉锻炼、电刺激、生物反馈等方法治疗，但疗效有限；对于晚期患者，通常通过手术治疗，但仍有部分复发、再手术的可能[2-5]。近年研究表明，中药补中益气汤可有效防治盆腔脏器脱垂，特别是联合上述西医治疗时疗效更佳[6-7]，但是其起效机制仍不明确。盆腔脏器脱垂的发病机制也仍有争议，盆腔脏器依靠一个复杂的支持系统维持在正常的解剖位置，这个支持系统主要包括韧带和筋膜，而胶原在其中扮演了重要的角色，各种生理病理过程使胶原含量减少，导致韧带或筋膜弹性减弱不能对盆底器官起到应有的支撑作用，最终导致盆腔脏器脱垂的发生是比较一致的共识[8-10]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路是胶原代谢中重要的信号通路，盆腔脏器脱垂患者骶韧带中PI3K/Akt/FOXO1信号通路被激活，FOXO1通过下调抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)、含锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的表达激活氧化应激反应，引起Ⅰ型胶原蛋白的破坏[11]。在其他器官中，磷酸酶与张力蛋白同源基因(PTEN)是该通路的负性调控因子[12-13]，在盆底疾病中，PTEN的作用尚不明确。基于此，本实验通过观察正常大鼠和盆腔脏器脱垂大鼠子宫骶韧带组织中PTEN/PI3K/Akt/FOXO1信号通路相关因子和胶原蛋白Ⅰ(COL1A1)、胶原蛋白Ⅲ(COL3A1)表达情况，探讨了补中益气汤防治盆腔脏器脱垂的可能起效机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 自然分娩过3次的SPF级雌性SD大鼠20只，体重约300 g，同龄同级别无生育史雌性SD大鼠10只，均由上海吉辉实验动物饲养有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2017-0012。大鼠在上海同济生物医药技术有限公司饲养并进行实验操作，许可证号：SYXK(沪)2018-0034，动物实验伦理编号：TJHBLAC-2019-026。饲养环境：昼夜各半循环照明，湿度50%～60%，温度21～24℃。

1.2药物 补中益气汤，组方：黄芪15 g、人参15 g、白术9 g、当归9 g、柴胡9 g、升麻6 g、陈皮6 g、炙甘草9 g，饮片来源于上海中医药大学附属普陀医院，经煎熬、浓缩等处理制备成含原生药400 g/L的药液备用。

1.3主要试剂及仪器 PTEN、Akt、p-Akt、p-FOX1、FOX1、β-actin抗体购自美国Cell Signaling Technology(CST)公司；Mn-SOD抗体、COL1A1和COL3A1抗体购自abcam公司；GPX1抗体购自absin公司。蛋白裂解液(碧云天公司)；BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所；PVDF膜、Power-pac基础型电泳仪、转膜仪、化学发光成像仪购自美国 Bio-Rad公司 。

1.4实验方法 将10只健康无生育史雌性SD大鼠作为正常组。取20只自然分娩过3次的雌性SD大鼠，参考文献[14]方法制备盆腔脏器脱垂模型：大鼠称重后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取俯卧位固定，将6F弗莱氏导尿管插入阴道中约3 cm，并往气囊中注入生理盐水3 mL撑开阴道，用1-0号丝线将导尿管八字缝合于阴道口，将大鼠固定，取耻骨联合位于桌缘使导尿管下垂，给300 g拉力维持4 h后取出。2周后再行上述操作1次，常规饲养2周后在腹腔麻醉下行双侧卵巢切除术，术后常规饲养8周，将造模成功后大鼠随机分为模型组和补中益气汤组各10只。参考前期研究[15]，补中益气汤组大鼠给予补中益气汤7 mL/(kg·d)灌胃8周，模型组和正常组大鼠给予等量生理盐水灌胃8周。

1.5检测指标及方法 末次灌胃结束后处死各组大鼠，取骶韧带组织，采用Western blot法检测PTEN、p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1、GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表达情况，采用 RT-PCR法检测GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA表达情况。

1.5.1Western blot检测方法 提取子宫骶韧带组织蛋白，BCA蛋白定量后行蛋白变性，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，BSA封闭后分别行一抗孵育、二抗孵育。于暗室中取出条带，用吸水纸印干，将按照1∶1比例配置好的显影液均匀涂于膜上，每个条带200 μL。根据说明书设置好曝光条件，曝光拍照。以β-actin为内参物，Image J软件分析条带灰度值进行定量分析。

1.5.2RT-PCR检测方法 取各组大鼠子宫骶韧带组织，用Trizol裂解液和RNA抽提试剂盒提取总RNA,测定总RNA浓度和纯度,-80 ℃保存备用。将1 μg的总RNA根据TaKaRa的反转录试剂盒行cDNA反转录,按照TaKaRa荧光定量聚合酶链反应试剂盒操作步骤，在实时PCR扩增仪上进行PCR反应,反应条件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共45个循环。以β-actin作为内参基因；COL1A1(上游5’-TGGTGAGACGTGGAAACCTG-3’,下游5’-CTTGGGTCCCTCGACTCCTA-3’)、COL3A1(上游5’-GATGAGCCACTAGACTGCCC-3’,下游5’-GTCGCCATTTCTCCCAGGAA-3’)、GPX1(上游5’-CAGTCCACCGTGTATGCCTT-3’，下游5’-CCAGACGCTTCTGCAGATCA-3’)、Mn-SOD(上游 5’-TAAGGGTGGTGGAGAACCCA-3’，下游5’-TTAGAGCAGGCGGCAATCTG-3’)引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。各个基因的表达采用2-△△CT方法进行定量分析。

2 结 果

2.1各组大鼠骶韧带组织中PTEN、p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1、GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表达情况比较 与正常组比较，模型组大鼠骶韧带组织中PTEN、GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表达量均明显降低(P均<0.05)，p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1蛋白表达量均明显增高(P均<0.05)；与模型组比较，补中益气汤组大鼠骶韧带组织中PTEN、GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表达量均明显增高(P均<0.05)，p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1蛋白表达量均明显降低(P均<0.05)。见图1及表1。

表1 正常组和盆腔脏器脱垂各组大鼠骶韧带组织中PTEN/PI3K/Akt/FOXO1通路相关因子蛋白相对表达量比较

2.2各组大鼠骶韧带组织中GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA表达情况比较 模型组大鼠骶韧带组织中GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA相对表达量均明显低于正常组(P均<0.05)，补中益气汤组大鼠骶韧带组织中GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2 正常组和盆腔脏器脱垂各组大鼠骶韧带组织中GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA相对表达量比较

3 讨 论

盆腔脏器脱垂是影响老年女性健康的重要疾病，其诊断和治疗已日益受到重视。目前，西医对轻度患者以物理治疗为主，对中重度患者以手术治疗为主，但效果不理想。中医对盆腔脏器脱垂的治疗积累了不少经验，认为其病机可归纳为中气不足或肾气不固、湿热下注, 其中中气不足、气虚下陷最为常见。脾为气血之源，司中气，脾虚则中气不足，气虚下陷，冲任不固，带脉失约，无力系胞，因此临证治疗宜补虚、举陷、固脱[16]。补中益气汤出自李东垣《内外伤辨惑论》，有补中益气、升阳举陷之功，主治一切中气不足之证，与盆腔脏器脱垂的病机相吻合。相关研究证实,补中益气汤联合生物反馈或盆底功能训练可有效防治盆腔脏器脱垂[17-18]。艾阳等[19]研究报道，补中益气汤能影响正常骶韧带成纤维细胞转化生长因子β3(TGF-β3)、COL1A1、COL3A1 mRNA的表达，对盆腔脏器脱垂的治疗作用可能与调节TGF-β3、COL1A1、COL3A1的表达有关。本课题组前期研究提示，补中益气汤可增加盆腔脏器脱垂大鼠子宫骶韧带组织中COL1A1、COL3A1 的合成，其作用机制可能与上调大鼠子宫骶韧带组织中TGF-β3和降低微小核糖核酸-30d的表达水平有关[15]。但盆腔脏器脱垂的发病机制复杂，补中益气汤也可能通过其他作用靶点发挥作用。

本实验基于PI3K/Akt/FOXO1通路的研究结果显示，模型组大鼠子宫骶韧带组织中p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1蛋白表达量较正常组明显升高，GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表达量及GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA表达量较正常组明显降低。其中Akt为PI3K/Akt信号通路激活的调控开关，p-Akt蛋白的高表达提示该通路被激活，引起氧化应激反应，抑制胶原蛋白合成。与模型组比较，补中益气汤组骶韧带组织中p-Akt/Akt、p-FOX1/FOX1蛋白表达量明显降低，GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1蛋白表达量及GPX1、Mn-SOD、COL1A1、COL3A1mRNA表达量明显升高，提示补中益气汤可能通过抑制PI3K/Akt/FOXO1通路上调抗氧化酶GPX1、Mn-SOD的表达，从而抑制氧化应激反应，进而影响胶原蛋白的合成而起到治疗盆腔脏器脱垂的作用。

第10号染色体缺失的PTEN不仅在肿瘤及纤维化的病理生理过程中起到重要作用[20-21]，而且与内分泌疾病如糖尿病[22]、免疫系统疾病如系统性红斑狼疮疾病[23]、脂质代谢疾病[24]和神经精神类疾病[25-26]的发生相关。PTEN通过多条信号转导通路参与细胞的生长、增殖、迁移、代谢和自我更新等，其中PI3K/Akt信号通路是它调控的主要途径，PTEN作为负性调控因子，可拮抗PI3K作用，使PI3K作用的底物发生去磷酸化，PIP3脱磷酸形成PIP2来阻断该通路。本实验结果显示，模型组大鼠骶韧带组织中PTEN表达量降低，而补中益气汤组明显升高。推测在盆腔脏器脱垂疾病中，PTEN同样作为负性调节因子，调控PI3K/Akt/FOXO1通路介导的氧化应激反应，PTEN的下调解除了对该通路的抑制作用，该通路激活引起胶原蛋白的破坏而导致盆腔脏器脱垂的发生，而补中益气汤能促进骶韧带组织中PTEN的表达，抑制PI3K/Akt/FOXO1通路激活，从而阻止胶原蛋白的进一步破坏，这可能是补中益气汤对盆腔脏器脱垂治疗起效的机制之一。

综上所述，盆腔脏器脱垂大鼠骶韧带组织中PTEN蛋白表达上调，p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1被显著激活，受FOXO1调节的抗氧化酶GPX1、Mn-SOD 蛋白和mRNA表达下调。补中益气汤可通过上调大鼠子宫骶韧带组织中PTEN的表达而抑制PI3K/Akt/FOXO1通路的激活，使抗氧化酶GPX1、Mn-SOD蛋白和mRNA表达上调而抑制氧化应激反应，促进胶原的合成，即补中益气汤可能通过调控PI3K/Akt/FOXO1通路而发挥作用，但也不排除其他起效机制，其治疗该类疾病起效的具体作用靶点和机制仍需进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。