槐耳有效部位冻干粉的体外细胞药效及细胞迁移、侵袭转移实验研究

李永盛 祝丽欣 张乐军 梅紫薇 俞忠明#

1 浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

2 浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007

3 丽水市中心医院 浙江 丽水 323000

槐耳为多孔菌科真菌槐栓菌Trametes robiniophila Murr.的干燥子实体。临床和实验研究表明[1]，槐耳可以通过对固有免疫和适应性免疫的调节，发挥间接抗肿瘤作用，能抑制肿瘤的增殖及迁移作用，诱导恶性肿瘤细胞凋亡，对正常细胞毒性小，故在肝癌、乳腺癌、胃肠癌和胰腺癌等多种肿瘤中广泛使用[2]，并取得了较好的临床疗效[1]。本实验在前期研究的基础上，将槐耳有效部位制备成冻干粉，通过细胞体外增殖抑制实验和划痕实验，观察其对人结肠癌细胞HCT-116的体外增殖抑制作用及对细胞迁移、侵袭能力的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器：ZD-A30J冷冻干燥机（南京载智自动化设备有限公司）；JA203H型电子天平（常州市幸运电子设备有限公司）；Varioskan Flash多功能酶标仪（Thermo）。

1.2 试剂与药材：槐耳饮片（浙江佐力百草）；槐耳颗粒（启动盖天力药业）；五氟尿嘧啶（5-Fu，K0084）；泊洛沙姆（20160820，永华化学），甘露醇（20140823，强顺化学）；MTT（150208），0.25%胰蛋白酶（21467 E16），DMEM（8114096），均购于Gibco公司；优级胎牛血清（FBS）（1616966），磷酸盐缓冲盐（PBS）（D221FA0007），购于BBI公司；二甲基亚砜（DMSO）（WXBB8079V，Sigma公司）；辅料均为药用，实验用水为生理盐水。

2 方法与结果

2.1 槐耳有效部位冻干粉的制备[3,4]：称取槐耳有效部位提取物浸膏粉10g，加入甘露醇25g、泊洛沙姆2.5g、生理盐水250mL，50℃加热，超声助溶，摇匀。将溶液转至西林瓶，每瓶25mL（液面高约13mm），-56℃慢冻法预冻3h，-15～-10℃升华干燥12h，45～50℃解析干燥9h，得槐耳有效部位冻干粉制剂。

2.2 冻干粉体外细胞药效研究：具体如下。

2.2.1 试药的配置：称取槐耳颗粒1000mg、自制冻干粉200mg、5-Fu 40mg，并将其分别用10mL不含血清培养基溶解，各自配置成适宜浓度的母液，备用，给药时再依次梯度稀释至所需浓度。

2.2.2 实验分组：A组（单用槐耳颗粒）、B组（单用自制冻干粉）、C组（单用5-Fu）、D组（自制冻干粉+5-Fu联合）、E组（槐耳有效部位浸膏+5-Fu联合），F组（阴性冻干粉组），并设立阴性对照组。

2.2.3 体外肿瘤细胞增殖抑制试验[5,6]：采用MTT法测定不同浓度药物对肿瘤细胞的影响，给药平行设置5个复孔，同时设置不添加细胞悬液为空白对照组，平行实验3次。给药后细胞在同样条件的培养箱内继续培养24h或48h后采用MTT法测细胞活性，于多功能酶标仪上490nm处测定各孔的光密度（OD）值，以正常对照组（未给药组）测得的OD值为对照，按照抑制率公式计算槐耳各提取物组对于肿瘤细胞增殖的抑制效果，根据各浸出部位浸膏得率转化成相应浸膏用量，计算出IC50值。抑制率=[1-（实验组MTT检测OD值-空白组OD）/（正常对照组MTT检测OD值-空白组OD）]×100%。

2.2.4 试验结果与分析：结果见表1。由表1可知，各组均显示48h药效较24h药效好，说明对细胞的体外增殖抑制作用均显示具有时间依赖性；A与B比较结果显示，自制冻干粉制剂的体外细胞药效较市售槐耳颗粒佳，其原因可能与冻干粉能增加槐耳有效部位的溶解有关；C、D、E结果对比显示，联合用药组较单用5-Fu组药效更佳，其中冻干粉与5-Fu联合用药组最佳，其次浸膏与5-Fu联合用药组，冻干粉与5-Fu联合用药可以明显降低5-Fu的用量（P＜0.01），说明冻干粉与5-Fu可能产生了协同作用，具体作用机理需要进一步的研究。

表1 槐耳有效部位冻干粉对体外药效试验

2.3 细胞迁移、侵袭转移实验：具体如下。

2.3.1 药物的配置：称取自制冻干粉、槐耳颗粒及5-Fu适量，并将其分别溶于不含血清培养基中，配置成适宜浓度的母液，给药时再依次梯度稀释至所需浓度。

2.3.2 实验分组：A组（空白对照）、B组（单用槐耳颗粒剂，浓度为8000μg/mL）、C组（单用自制冻干粉，浓度为500μg/mL）、D组（单用5-Fu，浓度为10μg/mL）、E组（自制冻干粉500μg/mL+5-Fu 10μg/mL）。

2.3.3 制备单层细胞：用记号笔在6孔板背面划出均匀的横线，每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。将浓度5～10×105个/mL的HCT-116肿瘤细胞接种到6孔板上，每孔加入2mL，加入含10%FBS的培养液，放入5%CO2细胞培养箱培养24h，使形成单层细胞。

2.3.4 划痕：待细胞达约90%汇合时，用5μL移液枪枪头在细胞上垂直划呈“一”字划痕。用PBS轻轻冲洗细胞3次，去除划下的细胞，然后加入不同浓度的药液，每个浓度设置3个复孔为平行样本，且重复3次。

2.3.5 观察并拍照：吸去培养液，用PBS清洗3次，按划痕后0h、24h取样，在倒置显微镜下观察、拍照。用Im‐age J 7.0图像处理软件计算划痕愈合率。

2.3.6 试验结果与分析：划痕实验能反映癌细胞的迁移能力，由表2可知，与空白对照组相比，单独应用冻干粉组能明显降低结肠癌HCT-116细胞的划痕愈合率（P＜0.01），冻干粉和5-Fu联合应用与单独应用冻干粉相比，效果更明显（P＜0.01），说明冻干粉能降低结肠癌HCT-116细胞迁移能力，且与5-Fu联合应用效果更佳。

表2 划痕实验结果

3 讨论

3.1 体外细胞药效实验：5-Fu为临床治疗消化道恶性肿瘤的最常用药物之一，但该药容易产生耐药性，而且作为细胞毒性药物，其毒副作用也较明显。这些临床中存在的实际问题促使我们思考是否可以通过联合中药，在不降低疗效的情况下减少5-Fu的用量，降低化疗药耐药性，并在此基础上研究试验新型安全、高效、低毒性的药物。本实验的主要目的是考察自制冻干粉能否降低化疗药物5-Fu的用药量。实验对阴性空白冻干粉的细胞毒性进行了研究，结果表明其于2000μg/mL浓度下对结肠癌HCT-116细胞无细胞毒性。

3.2 细胞迁移、侵袭转移实验：结果出现迁移率太小以及存在迁移率为负值的情况，原因可能是给药剂量太大所致，所以划痕实验的给药剂量最好控制在IC50值以下为宜。