右美托咪定在减轻脂多糖诱导人肾小管上皮细胞损伤中的作用研究

林宗斌 朱静文 朱峥 邵自强 刘景全 孙仁华

重症监护病房超过50%的急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）与脓毒症有关[1]。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）引起的肾小管上皮细胞损伤是脓毒症AKI发生的关键病理生理学环节，但其损伤机制不明[2]。干扰素调节因子1（interferon regulatory factor 1,IRF1）是一种重要的核转录因子，近年来的研究发现，IRF1可以对细菌感染产生响应，调控一系列与炎性反应、细胞增殖、凋亡相关的基因表达[3]。有研究显示，IRF1在LPS及缺血-再灌注等原因导致的器官损伤过程中发挥着一定的作用[4]。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一种镇痛、镇静药物，广泛应用于手术麻醉。近期研究表明，DEX还具有减轻炎症及调控免疫功能的作用。一些研究发现，DEX可以减轻包括脓毒症引起的多种器官损伤[5]。但是DEX对脓毒症患者脏器功能保护作用的机制尚不明确。本研究通过分析LPS及DEX处理后肾小管上皮细胞RNA测序的结果，探讨DEX在减轻LPS诱导肾小管上皮细胞损伤中的作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞培养 人肾小管上皮细胞（human kidney-2,HK-2）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。细胞培养采用添加10%FBS及1%青-链霉素的最低必需培养基（minimum essential medium,MEM），培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司（批号：PM150410P，规格：500 ml），培养环境为湿度恒定的37℃、5%CO2培养箱。2～3 d使用胰酶消化传代1次，胰酶购自美国Gibco公司（批号：25200-056，规格：250 ml），取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2 方法

1.2.1 高通量RNA测序 使用10 μmol DEX（扬子江药业集团有限公司，批号：H20183220，规格：0.1 mg）或10 μg/ml LPS（上海 MedChemExpress公司，批号：HYD1056，规格：5 mg）处理HK-2 24 h，以未经任何处理的细胞作为对照细胞。使用Trizol试剂（美国Thermofisher公司，批号：15596018，规格：200 ml）提取细胞总RNA样本，通过HiSeq 2500系统进行RNA测序。

1.2.2 细胞转染 为上调细胞中的IRF1，以pcDNA3.0为骨架构建IRF1过表达质粒，命名为pcDNA3.0-IRF1。使用pcDNA3.0空质粒作为阴性转染对照。转染时质粒浓度为2 μg/ml。为下调细胞中的IRF1，设计合成针对IRF1的小干扰RNA（siRNA），命名为siRNAIRF1，使用不针对任何序列的siRNA作为阴性转染对照。转染试剂采用Lipofectamine 3000转染试剂（美国ThermoFisher公司，批号：L3000015，规格：1.5 ml）。

1.2.3 细胞分组 为探讨IRF1在DEX减轻LPS诱导的HK-2损伤过程中的作用，根据不同转染或药物处理方案将细胞分组：转染过表达阴性对照质粒为pcDNA3.1组、转染IRF1过表达质粒为pcDNA3.1-IRF1组、未经任何处理的细胞为空白对照组、转染siRNA对照同时LPS处理24 h为LPS+siRNA组、转染IRF1 siRNA同时LPS处理24 h为LPS+siRNA-IRF1组、LPS处理同时PBS处理为LPS+PBS组、转染过表达阴性对照质粒同时接受LPS及DEX处理24 h为LPS+DEX+pcDNA3.1组、转染IRF1过表达质粒同时接受LPS及DEX处理24 h为LPS+DEX+pcDNA3.1-IRF1组。

1.2.4 IRF-1 mRNA水平检测 采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）法，使用Trizol试剂提取各种处理后细胞的总RNA样本，利用Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，批号：11119ES60，规格：100次）进行反转录以合成cDNA。将合成的cDNA使用Hieff UNICON®Power qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，批号：11195ES03，规格：1 ml）进行定量扩增。所有PCR反应体系及反应条件参照试剂盒说明书。IRF1的正向引物序列为5'-ATGCCCATCACTCGGATGC-3'，反向引物序列为5'-CCCTGCTTTGTATCGGCCTG-3'。以GAPDH为内参，其正向引物为5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物为5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。使用 2-ΔΔCT法计算靶基因的相对表达量。

1.2.5 IRF-1蛋白水平检测 采用蛋白质印迹法，使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0013B，规格：100 ml）提取细胞的总蛋白样本。使用BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0012S，规格：200次）定量后，与上样缓冲液混合，98℃变性10 min。将样品等量上样于SDS-PAGE胶，100 V恒压电泳1 h。将蛋白转膜至PVDF膜，转膜条件为90 V恒压45 min。转膜后，使用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，然后与1∶1 000稀释的兔抗人IRF1多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号：8478S，规格：20 μl）室温孵育4 h。使用1∶5 000的GAPDH一抗作为内参一抗（美国Cell Signaling Technology公司，批号：5174S，规格：20 μl）。PBST洗去一抗后，与1∶2 000辣根过氧化物酶标记的抗兔lgG二抗（美国Cell Signaling Technology公司，批号：7074S，规格：1 ml）室温孵育2 h，ECL超敏显色液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0018FS，规格：100 ml）显影、拍照。

1.2.6 细胞活性检测 将各组细胞种植于96孔板，密度为5 000个/孔。贴壁24 h后，进行对应的各种转染或药物处理，使用细胞计数试剂盒-8（cell counting Kit-8,CCK-8）细胞活性试剂（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0037，规格：100次）检测细胞活性，检测时间点为0、24、48、72 h。0 h为细胞贴壁后未处理时。检测时弃去原有培养基，加入100 μl 1∶10稀释的CCK-8试剂，孵育1 h后使用酶标仪（美国BioTech公司，型号：ELX808）检测450 nm处吸光度。相对细胞活性=其他时间点吸光度/0 h吸光度，计算各组细胞活性。

1.2.7 细胞增殖检测 将各组细胞种植于96孔板，密度为5 000个/孔。贴壁24 h后使用BeyoClick EdU-488试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0071s，规格：100次）进行EdU染色并拍照，EdU染色阳性细胞为增殖细胞。

1.2.8 细胞凋亡检测 将各组细胞种植于96孔板，密度为5 000个/孔。贴壁24 h后使用RealTime-Glo Apoptosis试剂盒（北京普洛麦格生物技术有限公司，批号：JA1000，规格：100次）检测凋亡情况。反应体系和方案按照试剂盒说明书，使用化学发光检测仪（瑞士Tecan公司，型号：SPARK 10M）以凋亡信号值记录各组读数。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS及DEX处理后HK-2细胞的RNA测序结果LPS处理后共测出1 934个显著上调的基因（表达倍数＞1.5，P＜0.05），463个显著下调的基因（表达倍数＜-1.5，P＜0.05），见图1a；按照显著性排名前10位的mRNA见图1b。DEX处理后的HK-2细胞共测出3 712个显著上调的基因（表达倍数＞1.5，P＜0.05），1 179个显著下调的基因（表达倍数＜-1.5，P＜0.05），见图1c；按照显著性排名前10位的mRNA见图1d。其中IRF1在LPS处理后的细胞中上调（表达倍数=6.65，P＜0.05），在DEX处理后的细胞中下调（表达倍数=-4.18，P＜0.05），见图1e。

图1 LPS及DEX处理后HK-2的RNA测序结果（a：LPS处理后HK-2的mRNA表达谱；b：LPS处理后变化显著性排名前10位的mRNA；c：DEX处理后HK-2的mRNA表达谱；d：DEX处理后变化显著性排名前10位的mRNA；e：LPS及DEX处理后的共同差异表达基因为IRF1）

2.2 LPS及DEX处理后HK-2细胞IRF1 mRNA表达水平比较 LPS处理后的IRF1 mRNA水平为2.69±0.33，高于对照组的1.00±0.12（P＜0.05），而DEX处理后的IRF1 mRNA水平为0.51±0.09，低于对照组的1.00±0.11（P＜0.05）。蛋白质印迹法检测结果显示，LPS促进IRF1的蛋白表达，而DEX抑制IRF1的蛋白表达，见图2。

图2 LPS及DEX处理后HK-2的IRF1 mRNA表达水平比较（a：LPS处理后IRF1 mRNA水平与对照组比较；b：DEX处理后IRF1 mRNA水平与对照组比较；c：LPS及DEX处理后IRF1蛋白表达电泳图）

2.3 HK-2转染过表达质粒及siRNA后IRF1 mRNA水平及蛋白水平比较 转染IRF1过表达质粒后，HK-2细胞IRF1 mRNA水平由1.00±0.12升高至22.00±3.61（P＜0.05）。转染IRF1的siRNA后，细胞内IRF1 mRNA水平由1.00±0.14降低至0.12±0.02（P＜0.05）。转染IRF1过表达质粒后，IRF1的蛋白水平升高，转染IRF1的siRNA后，IRF1的蛋白水平降低，见图3。

图3 HK-2转染过表达质粒及siRNA后IRF1 mRNA水平及蛋白水平比较（a：HK-2转染过表达质粒后IRF1 mRNA水平；b：HK-2转染siRNA后IRF1 mRNA水平；c：转染后IRF1蛋白表达电泳图；与阴性转染对照组比较，*P＜0.05）

2.4 改变IRF1水平后HK-2细胞活性、增殖及凋亡指标的比较 与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-IRF1组72 h细胞活性降低（2.10±0.02比 1.56±0.16，P＜0.05），见图4a。EdU染色显示，pcDNA3.1-IRF1组24 h细胞增殖减少，见图4b。pcDNA3.1-IRF1组24 h的凋亡信号值为62 183.26±7 585.39，高于pcDNA3.1组的20 523±2 051（P＜0.05），见图4c。LPS+siRNA组72 h细胞活性为0.65±0.08，低于空白对照组的1.91±0.21（P＜0.05），LPS+siRNA-IRF1组 72 h细胞活性为1.23±0.13，高于LPS+siRNA组（P＜0.05），见图4d。Edu染色显示，LPS+siRNA组24 h的细胞增殖减少，LPS+siRNA-IRF1细胞增殖高于LPS+siRNA组，见图4e。LPS+siRNA组24 h的细胞凋亡信号值为85 233.59±7 952.23，高于空白对照组的32 100.02±4 253.63（P＜0.05），LPS+siRNA-IRF1组的24 h细胞凋亡信号值（62 187.24±8 742.68）低于LPS+siRNA组（P＜0.05），见图4f。

图4 改变IRF1水平后HK-2细胞增殖及凋亡指标的比较（a：IRF1过表达后不同时间点细胞活性比较；b：IRF1过表达后细胞增殖比较的EdU染色荧光图；c：IRF1过表达后细胞凋亡比较；d：LPS及IRF1敲减后的细胞活性比较；e：LPS及IRF1敲减后细胞增殖比较的EdU染色荧光图；f：LPS及IRF1敲减后细胞凋亡的比较；与对照组比较，*P＜0.05；与阴性转染对照组比较，△P＜0.05）

2.5 DEX及LPS处理后HK-2细胞活性、增殖及凋亡指标的比较 空白对照组72 h细胞活性为2.53±0.23，LPS+PBS组为0.87±0.12；LPS+DEX+pcDNA3.1组72 h细胞活性为1.78±0.20，高于LPS+PBS组（P＜0.05）；LPS+DEX+pcDNA3.1-IRF1组72 h细胞活性为1.22±0.12，低于LPS+DEX+pcDNA3.1组（P＜0.05），见图5a。EdU染色结果显示，LPS+PBS组细胞增殖受到抑制，而LPS+DEX+pcDNA3.1组增殖得以部分恢复，LPS+DEX+pcDNA3.1-IRF1组增殖再次被抑制，见图5b。空白对照组24 h细胞凋亡信号值为29 000.68±3 212.55，LPS+PBS组24h细胞凋亡信号值为98 521.00±456.8.73；LPS+DEX+pcDNA3.1组24h细胞凋亡信号值为55254.64±6 211.53，低于LPS+PBS组（P＜0.05）；LPS+DEX+pcDNA3.1-IRF1组24 h细胞凋亡信号值为74 524.63±8 563.66，高于LPS+DEX+pcDNA3.1组（P＜0.05），见图5c。

图5 DEX及LPS处理后HK-2细胞增殖及凋亡指标的比较（a：LPS处理条件下，DEX及IRF1过表达后不同时间点细胞活性比较；b：LPS处理条件下，DEX及IRF1过表达后细胞增殖的EdU染色荧光图；c：LPS处理条件下，DEX及IRF1过表达后细胞凋亡比较；与对照组比较，*P＜0.05；与PBS对照组比较，△P＜0.05；与pcDNA3.1空质粒相比较，▲P＜0.05）

3 讨论

目前对于脓毒症AKI的防治提倡“提高预防意识”“提高整体观念”“动态评估”及“早期干预”[6]。肾小管上皮细胞是肾脏结构和功能的基础，探讨脓毒症过程中肾小管上皮细胞损伤的分子机制对脓毒症AKI的防治具有较大的临床应用价值[7]。越来越多的证据表明，DEX具有应用于脓毒症器官保护的潜力[8]，但在实现其在脓毒症AKI治疗的临床应用之前，需要揭示DEX减轻脓毒症引起的肾小管上皮细胞损伤的机制。本研究围绕上述科学问题进行了研究，结果发现DEX通过介导IRF1的表达变化减轻脓毒症过程中LPS对肾小管上皮细胞的损伤。

IRF1编码的蛋白质是一种转录调节因子，参与先天性和获得性免疫应答的基因激活；同时参与机体对病毒和细菌反应的基因转录，在细胞增殖、凋亡、免疫反应和DNA损伤反应中发挥作用[9]。近期的证据提示过高的IRF1参与LPS引起的细胞损伤。比如Yan等[10]发现IRF1调控LPS诱导的血管细胞粘附分子-1表达，引起内皮细胞的损伤；Yokota等[11]的研究发现IRF1通过产生IL-15/IL-15Rα促进肝移植后肝细胞的缺血/再灌注损伤。Deng等[12]的研究提出IRF1的过度激活参与LPS诱导的巨噬细胞线粒体损伤和氧化应激反应。还有研究发现，胡椒碱可以降低巨噬细胞中的IRF1水平，从而降低LPS造成的损伤[13]；本研究发现IRF1的过表达可以抑制细胞增殖，诱导凋亡，提示过高的IRF1可以引起细胞损伤。敲减IRF1后，LPS引起的肾小管上皮细胞损伤得以减轻。因此，本研究认为LPS可能通过上调IRF1来发挥肾小管上皮细胞损伤功能。

DEX对呼吸功能无抑制作用，并能保持患者的易唤醒状态，除镇痛、镇静外，还能抗焦虑、稳定循环等作用。如能将该药用于脓毒症器官保护，势必能扩大其临床价值。DEX对脓毒症器官保护的作用已经在心脏、肝脏等器官中得到了证实[14-15]。DEX对脓毒症条件下肾脏的保护作用机制主要包括DEX能够减轻炎症反应，减轻氧化应激、抑制细胞凋亡以及促进细胞自噬。如Zhao等[16]发现DEX通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路增强自噬抑制LPS介导的AKI。Feng等[5]的团队指出DEX通过GSK-3β/Nrf2信号通路抑制炎症和氧化应激，改善LPS诱导的大鼠AKI。Yang等[17]基于患者的研究发现DEX灌注保护了脓毒症休克患者的肾功能。这些研究多关注肾功能整体水平，较少有研究基于肾小管上皮细胞这个层面。本研究利用体外细胞模型发现DEX抑制IRF1水平，而过表达IRF1抵消了DEX的保护功能。所以DEX可以通过抑制IRF1的水平发挥对肾小管上皮细胞的保护作用。尽管本研究发现IRF1在DEX及LPS处理后肾小管上皮细胞中存在表达变化，并初步分析了IRF1扮演的功能角色，证实了IRF1介导了DEX的肾小管上皮细胞保护作用，但是本研究未能揭示IRF1发挥作用的分子机制，有待未来进一步研究。

综上所述，LPS诱导的肾脏上皮细胞损伤过程中存在IRF1的表达上调，IRF1对肾小管上皮细胞增殖和凋亡具有调控作用。DEX处理可以降低小管上皮细胞中的IRF1表达，其可通过抑制IRF1减轻脓毒症诱导肾小管上皮细胞损伤的作用。本研究对DEX的器官保护作用做出了分子机制上的解释，对DEX应用于脓毒症导致的器官损伤的防治提供了依据。