适宜制备浓香型大曲的植被生态评价研究

蒲吉洲，文 静，廖 丽，杨泽明，李佳鑫，邹永芳，陈识澳，青 倩

（1.舍得酒业股份有限公司，四川射洪 629200；2.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644005）

“曲为酒之骨”，大曲作为白酒生产不可或缺的糖化发酵剂，在为白酒发酵提供微生物的同时，也提供了大量的酶和原料物质，大曲的品质与白酒的品质和产量有着密切的关系。大曲是开放式生产，原料、空气、工具、场地等生态环境中的微生物可以通过自然接种方式在曲坯上富集形成复杂微生物群落。目前大量研究表明，大曲的生产与环境中的微生物密切相关，例如不同的生产环境、地理因素等会造成大曲品质的差异；不同地区生产的大曲质量和微生物组成群落有较大的差异；不同季节、不同地域生产的大曲微生物群落不相同。目前有许多研究学者针对大曲与生产环境存在的关系开展了大量研究。唐玉明等对曲房上中下不同位置空气微生物进行分析，发现空气中酵母菌和细菌与大曲酸度呈显著相关。Du在类似的研究中表示新大曲中有82 %的细菌来源于原料，10 %来源于室内地面，2%来源于室内空气；生产工具、室内地面、室外地面共为新大曲提供了超过90 %的真菌。可见酿酒微生物除了来源于室内、原料、空气等，还来源于室外地面。

《美国国家科学院院刊》上的一项研究结果表明，土壤微生物多样性与作为凋落物的植物化学组分的多样性存在正相关。土壤是生态环境的基础，其物理化学性质、养分的有效性、区域气候、植被类型等众多环境因素会对土壤微生物群落结构和组成产生影响。如植被类型，它除了有维持生态系统物种多样性、主导群落更新演替、加速群落植被恢复进程等多种功能，还可以通过凋落物和分泌物为土壤微生物提供营养，促进植物和微生物之间的协同进化，提升土壤微生物的多样性。目前关于植被对制曲微生物的影响还鲜有报道。

因此，本试验采用高通量测序、理化检测、植被组成等对制曲植被、植被下土壤及制曲相关微生物进行分析，运用相关性、主成分、聚类分析探索浓香大曲相关微生物、土壤、植被组成之间的关联。本研究以沱牌舍得制曲园区不同植被组成及土壤环境为研究对象，分析其微生物群落特征，土壤理化性质，分析影响土壤微生物分布的理化因素，并分析不同植被下与制曲相关的真菌、细菌。在此基础上，进一步探究制曲微生物与植被的关系，以建立适宜浓香制曲的植被生态评价，为生态酿酒提供科学的指导。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：见1.2.1样品采集部分。

试剂及耗材：氢氧化钠、碳酸氢钠、硼酸等（均为分析纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；重铬酸钾、高锰酸钾、硫酸等（均为分析纯），成都市科隆化学品有限公司。

仪器设备：AT-710 自动电位滴定仪，日本京都电子公司；UV-5100B 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；K1100 全自动凯式定氮仪、SH220F 石墨消解仪，济南海能仪器股份有限公司；BSD-YZ2200 立式智能精密摇床，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；VeritiFAST 梯度聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)仪，美 国ABI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集

在制曲园区内根据植被组成设置5 个代表取样圈(编号C1—C5)，每圈设置20 个取样点，每个取样点在1 cm范围内采用“五点取样法”采集10～20 cm 深度腐殖层土壤(并记录植被组成)，立即混合成单个土壤样品共20 个土样。土样过2 mm 筛后分成两份，一部分自然风干，用于土壤物理和化学性质的测定；另一部分土样用于微生物测序，土壤真菌测序区域为ITS1，细菌测序区域为V4。

1.2.2 土壤理化性质测定

土样采用LU描述的标准土壤试验方法分析。烘箱105 ℃烘干24 h后测定含水量和容重；pH采用离子交换法测定；有机质和有机碳采用重铬酸钾氧化-外加热法测定；全氮采用微量凯氏定氮法测定；速效磷采用钼蓝比色法测定；速效钾采用比浊法测定。

1.2.3 生物信息学分析

使用FLASH(V1.2.7)对原始序列进行拼接，fastp(V0.19.6)对数据进行质控获得优化序列，使用Qiime2 (v2020.2)对数据进行降噪(DADA2)获得样本中真实的序列信息ASV(Amplicon Sequence Variant)，基于ASV 代表序列信息和丰度信息，进行后续的物种分类学分析、群落多样性分析等。物种注释方法为bayes 法，注释数据库为Silva138（细菌）、Unite8.0（真菌）。

1.2.4 数据处理与统计

基于上述分析，可以了解到游客对现阶段四川旅游团餐满意度的综合评价.本研究表明，在28个感知特征项中，每对变量的满意度均低于重要性，配对t检验也证明各项特征值的重要性和满意度之间存在着显著差异，这说明游客对四川旅游产品中的旅游团餐绩效表现各方面的满意度感知较低，特别是菜品质量是影响游客满意度的最主要因素.因此，在明确了应该优先改进的重点项目后，各利益相关主体不仅要采取具体措施来改善菜品质量，也要重视影响游客实际体验的用餐环境及用餐服务，才能全面提升四川旅游团餐的游客满意度，进而增强四川旅游产品的综合竞争力.

使用SPSS22.0 进行方差分析、主成分分析、相关性分析，显著水平设定为0.05；mothur 1.30 用于Alpha 多样性指数分析，使用丰富度指数Chao 指数和多样性指数Shannon 指数分析土壤微生物的alpha多样性。

2 结果与分析

2.1 代表圈土壤理化指标

由表1 和表2 可知，各圈容重、水解性氮、过氧化氢酶、磷酸酶活性存在显著性影响(P＜0.05)，其他指标差异性不大。

表1 代表圈层理化指标

表2 代表圈层理化指标

2.2 制曲车间植被组成情况

按照各圈取样点植被组成的相似性，归为10组，见表3。

表3 制曲车间主要植被组成

2.3 制曲相关微生物

2.3.1 制曲相关细菌

高通量测序在属水平上共鉴定出16 种存在于大曲中的主要细菌。制曲相关细菌分别为不动杆菌属()、放线菌属()、杆状细菌()、短芽孢杆菌()、棒状杆菌属()、肠球菌()、梭形杆菌属()、乳酸杆菌()、奈瑟氏球菌属()、嗜糖假单胞菌()、假单胞菌()、罗斯氏菌属()、葡萄球菌属()、糖多孢菌属()、链(状)球菌()、高温放线菌属()。其中假单胞菌()、乳酸杆菌()、高温放线菌属()相对丰度含量最高，为制曲相关优势菌属（见图1）。

图1 制曲车间土壤与大曲相关细菌及丰度变化

选择主要制曲相关细菌与理化指标进行相关性分析，见图2。由图2 可知，芽孢杆菌属()、高温放线菌属()、糖多孢菌属()、短芽孢杆菌()与土壤有机碳、有机质、速效钾、全氮含量正相关，与水解性氮、过氧化氢酶活性、容重负相关，此外这些制曲相关细菌与第三圈样品分布相关性较高，第三圈主要植被组成分布为5 号（珊瑚树，秤星树），6 号（桂花，银杏，沿阶草）即芽孢杆菌属()、高温放线菌属()、糖多孢菌属()、短芽孢杆菌()与珊瑚树，秤星树，桂花，银杏，沿阶草关系密切；假单胞菌(）属与水分含量、pH 值负相关，与有效磷含量、水解性氮、过氧化氢酶活性及容重正相关，与第五圈植被（松树、柏树）以及第二圈植被（紫薇，女贞，桉树，南天竹）相关性密切。

图2 细菌与理化指标进行相关性分析

2.3.2 制曲相关真菌

图3 制曲土壤与大曲相关真菌及其相对丰度变化

选择主要制曲相关真菌与理化指标进行相关性分析，由图4 可知，交链孢属()相对丰度与土壤pH 值显著负相关，与水分含量、磷酸酶活性、过氧化氢酶活性有一定负相关，与其他指标相关性不强。镰刀菌属（）受第一圈（桂花，沿阶草，腊梅，紫薇；紫薇，腊梅，沿阶草，桂花，南天竹）和第四圈（沿阶草，小香樟，桂花）样品影响最大，与水分含量和土壤pH 值关系最密切。与水分含量、有机碳含量、有机质含量、有效磷含量有较强的正相关，并与第二圈（紫薇，女贞，桉树，南天竹）、第三圈（珊瑚树，秤星树）植被分布关系密切。曲霉属()与水分含量有较强的负相关，与其他指标相关性不强。附球菌属()、假丝酵母属()与容重、过氧化氢酶活性和pH 值有微弱的正向关系，与其他指标均是负相关，并与第一圈（桂花，沿阶草，腊梅，紫薇；紫薇，腊梅，沿阶草，桂花，南天竹）、第二圈（紫薇，女贞，桉树，南天竹）和第三圈（珊瑚树，秤星树）植被关系密切。与容重有较强的正相关，与水分含量、有机碳含量、有机质含量有较强的负相关。主要受速效钾、脲酶以及过氧化氢酶影响。毛孢子菌属()与大多数理化指标有正向的关系。

图4 真菌与理化指标进行相关性分析

2.4 不同植被下理化指标及微生物分布情况

2.4.1 不同植被下土壤理化指标

按照各圈取样点植被组成的相似性，归为10组，将植被相似的取样点位土壤样品用于分析。由表4 和表5 可知，有机碳、全氮、速效钾在10 组植被组合下存在显著性差异，说明不同植被组合对其影响大；磷酸酶活性、容重不存在显著性差异；pH 值、水分、有机质、水解性氮等理化指标在10 组植被组合下有所差异但差异较小。

表4 10组植被状态下理化指标

表5 10组植被状态下理化指标

2.4.2 不同植被下真菌和细菌分布情况

由表6 可知，植被2 有最高的真菌多样性，最适宜真菌生长，植被6 组成下细菌的多样性最高，因此，十种植被组成中最适宜真菌和细菌生长的植被分别为：紫薇，腊梅，沿阶草，桂花，南天竹；银杏，沿阶草为主。

表6 不同植被下真菌细菌多样性指数及OTU数量

表7 统计了大曲相关真菌和细菌在不同植被下的丰度和频率。7 号（黄桷树，竹林）植被组成土壤下制曲相关真菌出现的频率最高，其次是6 号、5号；7 号（黄桷树，竹林）植被组成土壤下制曲相关细菌出现的频率也是最高的，其次是3 号、2 号。就相关菌出现频率而言，7 号（黄桷树，竹林）植被组成最适宜大曲相关微生物的生长，2 号、3 号、5 号也较适宜大曲相关微生物生长。从丰度来看，10 号、6号、5号植被土壤相关真菌总丰度最高，4号、7号、9 号植被组成土壤相关细菌总丰度最高。综合来看，5 号（珊瑚树，秤星树）和6 号（桂花，银杏，沿阶草）植被组成下，制曲相关真菌出现的频率和丰度均较高；7 号（黄桷树，竹林）植被下，制曲相关细菌丰度及出现频率均较高。

表7 不同植被下制曲相关微生物出现频率和丰度

2.5 制曲植被生态评价

2.5.1 主成分分析

对不同植被组成下的理化指标、微生物指标以及制曲相关微生物指标进行主成分分析。根据特征值大于1 的原则提取了6 个主成分，6 个主成分特征值分别为6.21、3.46、2.63、1.97、1.50、1.05，6 个主成分的方差贡献率分别为34.49 %、19.19 %、14.60%、10.96%、8.33%、5.82%，累计方差贡献率为93.4%，即这6个主成分能反映原始数据93.24%的信息量，因此可以将这6 个成分用于主成分分析。通过主成分分析得到表8 中的载荷系数，该系数能够反应各指标影响程度，绝对值越大表明该变量的贡献越大。

表8 主成分因子载荷矩阵

由表8 可知，主成分1 方差贡献率为34.49 %，有机碳、全氮、磷酸酶活性在主成分1 上的载荷较大；主成分2 方差贡献率为19.19%，制曲相关细菌出现频率、pH 值、水解性氮含量在主成分2 上的载荷较大；主成分3 方差贡献率为14.60 %，水分含量、有效磷、速效钾含量在主成分3 上的载荷较大；主成分4 方差贡献率为10.96%，制曲相关真菌、细菌丰度在主成分4 上的载荷较大；主成分5 方差贡献率为8.33%，土壤细菌Chao 指数在主成分5 上的载荷较大；主成分6 方差贡献率为5.82 %，脲酶活性在主成分6 上的载荷较大。将各指标主成分载荷除以相对应特征值开平方根（即特征向量），将得到的特征向量与标准化后的数据相乘，就可以得出主成分表达式。

主成分3、主成分4、主成分5、主成分6 得分计算方法同理(LH1'表示LH1标准化后的值)，见表9。

表9 主成分系数向量

根据公式计算各植被组成的主成分得分，把不同植被下的各指标标准化后的数据代入以上线性模型，可以计算出各类型植被分别在6 个主成分上的得分Zi。以各主成分的方差贡献率为权重，根据以下评价函数计算综合得分。

由表10 综合评分可知，植被组成3 综合评价得分最高，植被组3 成主要分布在制曲车间第二圈，植被组成7 得分第二。排行前5 的植被组成均与其环境土壤营养水平、微生物多样性、制曲相关微生物出现频率高的分布规律基本相符合，可见评价结果具有一定的参考价值。该评价结合了制曲相关微生物的分布，因此，各植被的得分高低能在一定程度上体现对于制曲活动的价值高低。

表10 制曲车间不同植被评价得分和排序

2.5.2 聚类分析

根据各植被综合评价得分对各类型进行系统聚类，以欧氏距离5 将10 种植被进行聚类。由图5可知，组合3（紫薇，女贞，桉树，南天竹）、组合5（珊瑚树，秤星树）、组合7(黄桷树，竹林)被归为一类，与主成分分析结果一致，说明这三组植被有益于生态制曲。

图5 制曲车间植被聚类分析结果

3 结论

研究结果表明，不同植被组下的土壤pH 值、水分、有机碳、有机质等理化指标都与浓香大曲真菌和细菌丰度等存在一定的相关性；10组植被下的土壤指标有机碳、全氮、速效钾存在显著性差异(P＜0.05)。综合不同植被组成环境下制曲相关微生物出现频数和丰度等，通过主成分析与聚类分析得出适宜浓香制曲微生态的植被生态：紫薇，女贞，桉树，南天竹；珊瑚树，秤星树；黄桷树，竹林。