许氏平鲉(Sebastes schlegelii)DAZ基因家族的鉴定及表达分析

孙敏敏，宋伟豪，吴 鹏，刘心田，齐 洁*

(1.中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东 青岛266003；2.中国海洋大学三亚海洋研究院海南省热带水产种质重点实验室，海南 三亚 572000；3.威海市渔业推广站，山东 威海 264400)

引 言

两性配子发生包括生殖干细胞有丝分裂、增殖和减数分裂以及减数分裂后精子发生等多个过程[1-2]。DAZ基因家族为这些过程在分子水平上的进化保守性提供了为数不多的证据，在脊椎动物和无脊椎动物的雄性和雌性配子的产生中起着重要的作用[3-4]。DAZ家族由基因Daz、Dazl和Boule组成，它们都编码RNA结合蛋白，其中包含一个保守的RNA识别基序(RRM)和一个或多个重复的DAZ基序[5]。Boule作为这个家族最古老的成员从原始的基底后生动物到脊椎动物都一直存在[3，6]，而Dazl从Boule进化而来，它从硬骨鱼到人都一直存在[7]。Daz只存在于高等灵长类动物中，位于Y染色体上，其序列包含七个DAZ结构域重复[8-9]。Dazl和Boule位于常染色体上[4，10]，它们与Daz基因共同编码RNA结合蛋白，在生殖细胞中特异表达，参与调控生殖细胞的发育和分化[5，11]。

DAZ基因家族通过调控 mRNA的翻译过程影响生殖细胞的发育分化并且这些蛋白质功能的丧失会导致雄性和雌性不育。Dazl和Boule是配子发生过程中不可缺少的调节因子[12-13]。小鼠中Dazl基因的缺失造成生殖细胞和配子的缺失，证实Dazl对于生殖细胞的分化是至关重要的[14]。在秀丽线虫中Boule突变体导致卵子发生障碍[15]。研究发现小鼠通过Dazl结合Vasa同源基因(Mvh)的3 '-UTR刺激翻译，Mvh是一种对雄性配子形成至关重要的基因，并发现Dazl缺失小鼠的生殖细胞中Mvh蛋白水平降低，说明Dazl介导的Mvh翻译调控对哺乳动物精子形成至关重要[16]。果蝇突变体缺失Boule使得Twine(一种cdc25型磷酸酶)失活，阻止其进入减数分裂[17]。研究表明Dazl和Boule基因不仅能直接调控生殖细胞发育分化，而且能影响其它生殖细胞相关基因的表达。在原始生殖细胞(PGCs)的起源、迁移、分化及配子发生研究中，DAZ基因家族作为标记基因参与生殖质mRNA的翻译。

非洲爪蟾中母体DazlmRNA的特异性缺失，导致PGCs严重缺乏且PGC迁移出现障碍，不能从腹侧迁移到背侧内胚层，也不能到达背侧肠系膜。Dazl能够作为一种RNA结合蛋白，调节介导PGCs迁移的因子的翻译或表达[11]。

研究人员已经在斑马鱼[18]、银鲫[19]、青鳉、罗非鱼[20]、虹鳟[21-22]、尖吻鲈[23]和牙鲆[24]等鱼类中对DAZ家族基因进行了克隆并分析了其表达模式，大多数硬骨鱼类Dazl和Boule均仅存在于性腺中，两者在配子发生时表现出阶段特异性的表达。青鳉[25-26]中关于Boule和Dazl的RNA表达模式的研究表明Boule和Dazl在有丝分裂和减数分裂生殖细胞中均有双性表达的现象。虹鳟[21-22]中，Dazl不仅表现在雌、雄配子发生的有丝分裂和减数分裂阶段中发挥作用，还能阶段特异性亚细胞定位到巴尔比亚尼体，而Boule没有定位到巴尔比亚尼体。Boule和Dazl是尖吻鲈成体中的生殖细胞标记物[23]，其在时空表达和亚细胞分布方面存在明显差异。Boule和Dazl的两性生殖细胞特异性表达在鱼类中一直比较保守。DAZ家族基因的表达与其在生殖系发育不同阶段的具体作用密切相关，故对DAZ家族基因在低等和高等脊椎动物中的表达比较进行分析，将为研究配子发生和生殖细胞分化的分子机制提供材料。

许氏平鲉(Sebastesschlegelii)为卵胎生的岩礁性鱼类，是一种重要的海产经济鱼类和增养殖优良品种。由于其卵胎生繁殖方式，人工繁殖尚未实现。因此，对重要的生殖细胞标记基因Dazl和Boule进行研究，对了解许氏平鲉的性别分化和发育机制具有重要意义。在本研究中，我们通过对Daz基因家族进行了结构分析、进化分析及表达分析，为进一步研究Dazl和Boule在许氏平鲉生殖发育机制和两性配子发生过程中的调控作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物来源与取样

本研究中所用的1龄半许氏平鲉成鱼来源于威海银泽生物科技股份有限公司。对许氏平鲉进行麻醉后断椎处理，取6条健康许氏平鲉成鱼(3条雄鱼和3条雌鱼)的10个组织(心、肝、脾、肾、脑、肠、鳃、肌肉、精巢、卵巢)，立即冷冻于液氮中，-80 ℃保存，用于RNA提取。并各取一块肌肉组织保存于95%乙醇中，用作DNA提取。我们收集了不同发育阶段(交尾前、交尾后和受精前)的雌性卵巢和不同发育阶段(1细胞期、32细胞期、囊胚期、原肠胚期、体节期和孵化期)的胚胎，液氮速冻并保存在-80 ℃，用于RNA提取。

1.2 总RNA提取、cDNA合成及基因组DNA的提取

许氏平鲉各组织及胚胎总RNA由TRIzol法(Invitrogen)提取，使用DNase I和RNA clean试剂盒去除RNA中的DNA和蛋白质，通过分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。cDNA由逆转录酶M-MLV试剂盒(TaKaRa)合成，使用许氏平鲉β-actin作为引物进行PCR检测反转录效果，并置于-80 ℃保存。

采用酚-氯仿的方法提取许氏平鲉基因组DNA，用分光光度计检测DNA的浓度，使用电泳检DNA的质量。

1.3 Boule和Dazl氨基酸多重序列比对和系统进化分析

从NCBI和Ensembl网站下载其它物种的Boule和Dazl氨基酸序列，同许氏平鲉的Boule和Dazl氨基酸序列用Genedoc软件进行氨基酸多序列比对。利用 MEGA7.0 的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)进行聚类分析构建进化树，各物种Boule和Dazl氨基酸序列的 Gene Bank 数据库注册序列号如下：

斑点雀鳝Lepisosteus_oculatus_Boule：XP_015213794.1；虹鳟Oncorhynchus_mykiss_Boule：ADW41783.1；鸡Gallus_gallus_Boule：XP_015144979.1；尖吻鲈Lates_calcarifer_Boule：KC992312.1；密西西比鳄Alligator_mississippiensis_Boule：XP_014449905.1；青鳉Oryzias_latipes_Boule：KC992312.1；人Homo_sapiens_Boule：NP_932074.1；鼠Mus_musculus_Boule：AAK69026.2；海龟Chelonia_mydas_Boule：XP_007072013.1；斑马鱼Danio_rerio_Dazl：NP_571599.1；半滑舌鳎Cynoglossus_semilaevis_Dazl：AGG69476.1；人Homo_sapiens_Dazl：NP_001177740.1；斑点雀鳝Lepisosteus_oculatus_Dazl：XP_015212852.1；大黄鱼Larimichthys_crocea_Dazl：KAE8282148.1；非洲爪蟾Xenopus_laevis_Dazl：NP_001081772.1；海龟Chelonia_mydas_Dazl：XP_007053304.1；虹鳟Oncorhynchus_mykiss_Dazl：NP_001233268.1；鸡Gallus_gallus_Dazl：NP_989549.1；尖吻鲈Lates_calcarifer_Dazl：ABB76649.1；孔雀鱼Poecilia_reticulata_Dazl：XP_008419892.1；青鳉Oryzias_latipes_Dazl：NP_001098269.1；鼠Mus_musculus_Dazl-8：NP_001264792.1；鼠Mus_musculus_Dazl-FL：NP_034151.3；牙鲆Paralichthys_olivaceus_DazlⅠ：AKE14490.1；牙鲆Paralichthys_olivaceus_DazlⅡ：AKE14491.1；人Homo_sapiens_Daz：AAB02393.1。

1.4 Boule和Dazl基因表达分析

将许氏平鲉不同组织、不同发育阶段卵子、以及胚胎发育时期的转录组TPM数据归一化后用pheatmap程序进行热图绘制，红色越深表示表达量越高，蓝色越深表示表达量越低。

2 结果

2.1 许氏平鲉Dazl和Boule基因结构分析

根据许氏平鲉基因组和转录组序列，tBlastx获得Dazl和Boule的cDNA序列且Dazl和Boule含有分别有两种mRNA存在于许氏平鲉性腺转录本，BouleⅠ，BouleⅡ以及DazlⅠ，DazlⅡ。两种转录本可能来自同一个拷贝基因，在转录和mRNA成熟过程中，BouleⅠ保留了10个外显子，而BouleⅡ由于在第一个外显子处缺失一部分序列，产生11个外显子。DazlⅠ保留了8个外显子，而DazlⅡ缺失外显子7，它们是可变剪接的产物。BouleⅠ，BouleⅡ以及DazlⅠ，DazlⅡ在序列的其它部分并没有差异，也没有转录时遗留的内含子序列，表明BouleⅠ，BouleⅡ以及DazlⅠ，DazlⅡ可能都有各自的蛋白产物且具有一定的生理功能。

图1 Dazl和Boule基因之间的比对。Dazl和Boule各存在两种剪接型。外显子由黄色方框表示，内含子由实线表示。

2.2 许氏平鲉Dazl和Boule氨基酸的多重序列比对

许氏平鲉BouleⅠ，BouleⅡ的cDNA长度分别为1 032 bp和1 008 bp，分别编码了343和335个氨基酸，DazlⅠ，DazlⅡcDNA序列开放阅读框分别为654 bp和603 bp，分别编码217和200个氨基酸。且Dazl和Boule都包含一个 RNA 识别域(RRM)和一个 DAZ 结构域(图2)。通过多物种Dazl和Boule的氨基酸序列比对(图2)，各物种在RRM序列区域有较高的保守性，其它区域保守性较低。在Dazl中RRM区域中非硬骨鱼和硬骨鱼存在差异的氨基酸，将硬骨鱼和其它物种分开(图2A)。Boule和Dazl基因属于同一基因家族，然而它们编码的蛋白序列却相差很大。许氏平鲉中Boule 与Dazl之间的同源性是较低的，在 RNA 识别结构域和 DAZ 重复区其同源性稍高，分别为 50%和30%。

图2 许氏平鲉Dazl和Boule与其它物种氨基酸的序列比对

2.3 许氏平鲉Dazl和Boule系统进化分析

利用来自不同物种的Dazl和Boule的氨基酸序列，通过MEGA 7.0程序构建系统发育树。系统发育树显示，进化树主要分为两个簇，分别为Dazl和Boule(图3)。许氏平鲉的Dazl首先与其它硬骨鱼的Dazl聚合在一起，然后与四足动物，鸟类或哺乳动物的Dazl聚集成一支。多重序列比对显示许氏平鲉Dazl先与尖吻鲈、大黄鱼、孔雀鱼聚集，后与斑马鱼等聚集，最后与青鳉聚为一支。氨基酸序列比对显示其与尖吻鲈序列最为相近，相似性达89.4%，与青鳉较远，相似度达73.3%。而许氏平鲉Boule先与尖吻鲈、青鳉聚集，后与斑点雀鳝、虹鳟及哺乳动物聚为一支。氨基酸序列比对显示其与尖吻鲈序列最为相近，相似性达73.6%，与斑点雀鳝较远，仅有30.2%。而Boule作为Daz基因家族最古老的基因，进化较为特殊，斑点雀鳝及虹鳟鱼先和哺乳动物聚为一支再与许氏平鲉等其它硬骨鱼聚为一支。结果表明，许氏平鲉Dazl和Boule较为保守，与哺乳动物亲缘关系较远，与其它硬骨鱼亲缘关系较近。

图3 许氏平鲉和其它脊椎动物DAZ基因家族的系统发育分析

2.4 许氏平鲉Dazl和Boule基因在成鱼各组织、胚胎发育不同时期表达量分析

根据转录组数据分析，许氏平鲉Dazl和Boule在成鱼各组织中的表达水平呈现相同的表达模式。Dazl和Boule均只在性腺中特异性表达，其它组织中没有表达(图4A)。此外许氏平鲉Dazl和Boule在性腺表现为雌雄两态表达模式，许氏平鲉Dazl在卵巢表达水平较精巢高，Boule与Dazl不同，精巢中的表达量明显高于卵巢。根据转录组数据分析可知Boule与Dazl在配子发生表达模式相似，均在交配前、交配后和受精前阶段较高，而在胚胎发育的时期几乎没有表达(图4B)，表明Boule与Dazl可能对于早期生殖细胞发育有重要作用，是配子生成的重要调控因子。

图4 通过转录组数据分析许氏平鲉Dazl和Boule基因的表达模式

3 讨论

本研究鉴定了DAZ基因家族，该家族包括三个基因：Daz[27]，Dazl[28-29]及Boule基因[30-31]。Daz基因缺失可出现少精子症或无精子症，从而导致雄性不育，是原始生殖细胞发育和生殖细胞分化成熟所必需的[32-33]。Dazl基因的无义突变可引起雌、雄双性不育，导致原始生殖细胞的缺失从而影响生殖细胞的发育[11，20]。Boule基因作为DAZ 家族重要的一员，是精子发生过程中调控减数分裂的关键因子[26]。Boule在减数分裂前后表达，功能较为有限。DAZ蛋白在体内外均与RNA结合，可能参与了mRNA表达的转录后调控。由于Daz基因仅存在于旧大陆猴和类人猿的 Y 染色体中[34-35]，故许氏平鲉中该家族仅包括Dazl和Boule。许氏平鲉Dazl和Boule具有DAZ 家族蛋白保守的 RNA 识别域和 DAZ 结构域[36]；DAZ结构域可能与蛋白质交互作用有关[37]，缺失RRM对其与DAZAPs(deleted in Azoospermia(Daz)-Associated Protein1)的结合影响不大，而DAZ结构域的缺失则大大减少了其结合[38]。研究表明，Daz和Dazl主要通过DAZ结构域与DAZAP1/DAZAP2结合[39]。DAZAP1 是与Daz相互作用的反式作用因子，对mRNA的降解和沉默起关键作用，DAZAP1的磷酸化能破坏其与生殖细胞特异性蛋白Daz的相互作用[40]。

之前研究确定了小鼠中Dazl有两个剪接型(Dazl_Δ8和Dazl_FL)，在成年小鼠精卵巢和多能细胞中表达。我们发现，Dazl8号外显子的选择性剪接导致缺失17个氨基酸，而其余蛋白结构相对于Dazl_FL是完整的[41]。亚细胞定位研究显示Dazl_Δ8类似于Dazl_FL蛋白质的定位模式。与生殖细胞的翻译刺激功能相比，Dazl亚型(Dazl_FL和Dazl_Δ8)功能分析证实了Dazl亚型均可在胚胎干细胞中具有翻译抑制作用。Dazl同源基因里类似的mRNA的可变剪接只发现于牙鲆[42]，缺失的8号外显子并不位于重要的RRM结构域，对Dazl功能影响不大，基本的RNA识别功能仍然保留，DazlⅠ和DazlⅡ表达模式相似，且从Dazl靶mRNA预测两种蛋白的功能发现没有仅受一种Dazl蛋白调控的mRNA，表明这两种蛋白没有明显的功能差异。而Boule还未发现有可变剪接的存在。在本研究中许氏平鲉Dazl和Boule均存在两种可变剪接，从氨基酸序列完整性看BouleⅠ，BouleⅡ以及DazlⅠ，DazlⅡ很可能都有其对应的蛋白产物。此外，可变剪接均存在于重要的结构域之外，对Dazl和Boule基本功能可能影响不大。但是可变剪接存在的意义可能在于出现新的功能。由于其基因序列不同，空间结构发生变化相应功能也会有所改变，新剪接型的蛋白产物或许即可保留原基因应行使的大部分功能，又发展出不同于基因完整型的新功能，需要进一步研究证实[43-44]。

多重氨基酸序列比对和系统进化树显示，硬骨鱼Dazl和Boule与其它脊椎动物有较大区别。RRM中数个氨基酸的改变及Dazl后端氨基酸序列数目可将硬骨鱼和其它高等脊椎动物区分开。许氏平鲉的Dazl和Boule分别与其它硬骨鱼同源基因聚类为一支，说明了许氏平鲉的Dazl和Boule在进化上相对保守，也反映了不同物种Dazl和Boule在的两性配子发生过程中及生殖发育调控机制具有重要的作用[45-46]。

Dazl和Boule基因的表达模式存在明显差异。在大多数已报道的哺乳动物中，Dazl基因只在两性生殖细胞中特异表达[47]。青鳉中Dazl在胚胎发生过程中始终存在，而在成鱼组织中，DazlmRNA及其蛋白的表达仅位于精巢和卵巢的生殖细胞中[25]。在精巢中，DazlmRNA在减数分裂前期较低，在减数分裂期较丰富，但在减数分裂后期缺失，在卵巢中，DazlmRNA在整个卵子发生过程中持续存在。大西洋鲑鱼Dazl在性腺中被检测到，在卵母细胞和随后的胚胎发育也检测到[48]。牙鲆Dazl同样特异性的表达于精卵巢，且在胚胎发育的各时期也有检测到其表达[18]，此外斑马鱼[32]、罗非鱼[20]、虹鳟[21]等硬骨鱼类Dazl均在两性生殖细胞中特异表达。在迄今为止所研究的各种生物中，Boule表现出明显的变异表达模式。哺乳动物[46]及果蝇[49]的Boule仅在雄性生殖细胞中表达，而秀丽线虫[44]仅在雌性中表达。对于硬骨鱼类中的研究显示，罗非鱼Boule基因表现出双性生殖系特异性表达，并且在两性配子发生时表现出阶段特异性的表达。虹鳟的Boule在雌雄性腺中均有表达且在精巢中表达量高，卵巢中表达量低[36]，在配子发生过程中Boule在雄性配子形成中出现在有丝分裂和减数分裂，而在雌性中表现出减数分裂特异性[21]。青鳉中Boule在两性生殖细胞中都有表达，而精子形成的表达模式与Dazl不同，在精子形成的减数分裂前期和减数分裂期均有表达，在卵子发生过程中与Dazl表达模式相似。本研究通过转录组分析得到许氏平鲉成鱼各组织及不同胚胎时期生殖基因Boule和Dazl的mRNA表达模式。我们发现，许氏平鲉的这两个基因都在两性性腺中特异性表达，其中Boule在精巢表达水平明显高于卵巢而Dazl在卵巢表达明显高于精巢。两者只在不同发育阶段卵子表达，而在胚胎发育时期表达量几乎检测不到。通过对不同生物的研究，证实了DAZ家族基因在性腺发育不同阶段的表达模式与其保守的特异性作用，而这种表达模式依赖于性腺和配子发生的阶段。本研究结果为许氏平鲉生殖和发育研究提供了重要的参考依据。

4 结论

在本研究中，我们主要进行了许氏平鲉DAZ基因家族的成员鉴定及转录组表达分析。经研究发现许氏平鲉DAZ基因家族包含两个成员：Dazl和Boule，分别有两个转录本。通过多重序列比对和系统发育分析，得到Dazl和Boule含有两个与其他硬骨鱼高度保守的功能结构域——DAZ结构域和RRM结构域。通过转录组数据分析，Dazl和Boule在许氏平鲉各组织中的表达模式相似，只在性腺中表达且存在性别二态现象。不同卵子发育阶段和胚胎期的表达分析表明，Dazl和Boule主要在配子发生期起作用。推测许氏平鲉Dazl和Boule影响生殖细胞的发育分化，是配子发生不可缺少的调控因子，为进一步研究Dazl和Boule在许氏平鲉性别分化和性腺发育中的作用提供参考。