血清VEGF、TK-1和T淋巴细胞亚群与乙型肝炎病毒相关性肝病发生和进展的关系

李慧平，侯宝洲，魏思忱，穆宗玮，李丽娟，田树英

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是导致肝炎的主要原因，HBV感染与肝纤维化、肝硬化甚至肝癌发生、发展存在密切联系[1-2]。临床诊断乙型病毒性肝炎(乙肝)及相关肝脏疾病方式较多，肝脏超声可反映组织的形态学改变，但其通常在细胞和组织功能障碍之后才有明显表现[3-4]。肝脏穿刺或者手术切除后病理检查是疾病诊断的“金标准”，但创伤性较大，不易推广。HBV相关性肝病病人的外周循环血液中多种细胞因子异常表达，与疾病发生和发展有关。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有强效诱导新生血管的作用，在肝脏损伤修复、纤维化形成等方面有重要作用[5]。可溶性胸苷激酶-1(thymidine kinase-1，TK-1)被证实与多种恶性肿瘤的发生和临床预后密切相关[6]。T淋巴细胞亚群是参与抗病毒的主要成分，与疾病发生和发展、抗病毒疗效以及生存预后直接相关[7-8]。基于此，本研究分析血清VEGF、TK-1和T淋巴细胞亚群与HBV相关性肝病的发生和进展的关系，为疾病诊断和治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用临床前瞻性病例对照研究的方法，选择2020年3月至2021年10月入我院确诊乙肝病人188例，其中单纯乙肝52例，肝纤维化40例，肝硬化56例，肝癌40例。纳入标准：(1)年龄>18岁；(2)符合《乙型肝炎诊断标准》[9]诊断标准，入院明确诊断为乙肝；(3)病人签署研究同意书，临床资料完整。排除标准：(1)合并丙肝、肝功能衰竭，既往肝脏外伤、手术、放化疗史；(2)入院前已经接受相关肝病药物的治疗；(3)严重心肺肾功能障碍、自身免疫性疾病、营养代谢性疾病；(4)妊娠、哺乳期女性。另选择30名健康体检者作为对照组。单纯乙肝组男32例，女20例，年龄36～65岁；肝纤维化组男26例，女14例，年龄39～71岁；肝硬化组男35例，女21例，年龄38～71岁；肝癌组男28例，女12例，年龄35～74岁；对照组男17名，女13名，年龄36～62岁。各组性别、年龄均有可比性。本研究取得我院医学伦理委员会审批。

1.2 方法 入院24 h内采集空腹外周静脉血12 mL于抗凝管中，2 500 r/min离心10 min分离上层血清和下层细胞沉淀，另转移至EP抗凝管中-80 ℃保存待检。采用PCR法检测HBV-DNA负荷量，试剂和仪器来源于达安基因诊断中心，按说明书进行操作。常规生化法检测肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)，采用德国ROCHE公司试剂和仪器进行检测。ELISA法检测VEGF和TK-1水平，试剂购自美国Sigma公司。流式细胞术检测T淋巴细胞亚群，包括CD3+、CD4+、CD8+百分比和CD4+/CD8+，淋巴细胞亚群分析试剂购自美国BD公司，按试剂说明书要求操作。

1.3 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 各组病人HBV-DNA负荷量及ALT、AST水平比较 单纯乙肝组、肝纤维化组、肝硬化组、肝癌组HBV-DNA负荷量及ALT、AST水平差异均无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 各组病人HBV-DNA负荷量及ALT、AST水平比较

2.2 各组VEGF和TK-1水平比较 肝癌组、肝硬化组、肝纤维化组、单纯乙肝组、对照组VEGF和TK-1水平逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.01)(见表2)。

表2 各组VEGF和TK-1水平比较

2.3 各组T淋巴细胞亚群比较 肝癌组、肝硬化组、肝纤维化组、单纯乙肝组、对照组CD4+/CD8+水平逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.01)；各组CD3+、CD4+和CD8+水平差异均无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

表3 各组T淋巴细胞亚群比较

2.4 HBV相关性肝病病人血清中VEGF、TK-1、CD4+/CD8+相关性分析 Spearman相关分析显示，HBV相关性肝病病人血清中VEGF与TK-1呈明显正相关关系(r=0.745，P<0.01)，VEGF与CD4+/CD8+呈明显负相关关系(r=-0.217，P<0.01)，TK-1与CD4+/CD8+呈明显负相关关系(r=-0.208，P<0.01)。

3 讨论

HBV感染呈世界性流行，全球约有2.57亿慢性HBV感染者，每年死于HBV感染相关肝病的病人有88.7万[10]。相关研究[11-13]显示，乙肝、肝纤维化、肝硬化和肝癌存在渐进式发展的内在联系，及时辨别乙肝病人病情转变进程对改善病人生存预后有十分重要的临床意义。本研究发现血清VEGF、TK-1和CD4+/CD8+变化与HBV相关性肝病的发生和进展有关，可通过关注乙肝病人VEGF、TK-1和CD4+/CD8+变化情况及时对其病情发展进行人工干预，具有一定的创新意义和临床指导价值。

ALKHARSAH[14]指出，一些病毒被认为是人类肿瘤和其他严重疾病的直接或间接病原体。致癌病毒如HBV缺乏自身的VEGF，它们依赖于在肿瘤进展中招募宿主细胞基因进行血管生成。MAO等[15]研究表明，乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)和VEGF在HBV相关性肝癌中广泛表达，HBx可能通过上调VEGF促进HBV相关性肝癌的发生和发展。SUN 等[16]研究发现，miR-21通过缺氧诱导因子-1α/VEGF信号通路诱导肝纤维化的发生。VIZIO等[17]研究还证明，VEGF-A对肝脏结构内的复杂血管网络至关重要，并协同血小板生成素促进从肝硬化到肝细胞癌的进展。本研究中，通过对乙肝病人不同病情进行分组发现，与健康体检者比较，单纯乙肝组、肝纤维化组、肝硬化组和肝癌组病人VEGF水平升高，且不同乙肝病情进展病人，其VEGF水平保持肝癌组>肝硬化组>肝纤维化组>单纯乙肝组变化趋势。

WANG等[18]指出，TK-1能够催化胸腺嘧啶核苷的初始磷酸化合成dTTP，dTTP是DNA的重要组成部分。TK-1是一种细胞溶质酶，在细胞周期的S期具有最高水平。在癌细胞中TK-1上调，过量的TK1泄漏到血液中。因此，血清TK-1被用作癌症诊断和预后的生物标志物。PAOLETTI等[19]开展的SWOG S0226临床试验发现，激素受体阳性的转移性乳腺癌病人一线内分泌治疗中，基线高水平TK-1与较差的预后相关。在本研究中，不同乙肝病情病人，TK-1水平保持肝癌组>肝硬化组>肝纤维化组>单纯乙肝组变化趋势。许琴等[20]研究表明，乙肝病人Th1细胞因子、T 淋巴细胞亚群及特异性细胞毒T淋巴细胞的表达，可监测疾病发展、病毒复制状态和转归，对指导抗病毒治疗和评价疗效有重要意义。在本研究中，不同乙肝病情进展病人，CD4+/CD8+保持肝癌组<肝硬化组<肝纤维化组<单纯乙肝组变化趋势。

此外，本研究还发现，单纯乙肝组、肝纤维化组、肝硬化组和肝癌组病人HBV-DNA负荷量、ALT水平、AST水平、CD3+、CD4+和CD8+百分比差异均无统计学意义，提示单纯依赖病毒学和肝功能检测无法准确判断肝病进程[21]。

通过对HBV相关性肝病病人血清中VEGF、TK-1和CD4+/CD8+水平进行相关性分析发现，VEGF与TK-1呈明显正相关关系，VEGF与CD4+/CD8+呈明显负相关关系，TK-1与CD4+/CD8+呈明显负相关关系，提示随着肝病病人血清VEGF与TK-1表达上调、CD4+/CD8+下降，病人存在乙型肝炎向肝纤维化、肝硬化甚至肝癌转变的可能，需及时进行人工干预。

综上所述，HBV相关性肝病病人血清中VEGF、TK-1和CD4+/CD8+与疾病的发生和进展密切相关，VEGF和TK-1表达升高，CD4+/CD8+下降可能参与了乙肝、肝纤维化、肝硬化和肝癌的发生与进展。本研究的创新点是筛查出与HBV相关性肝病进展的敏感性标志物VEGF、TK-1和CD4+/CD8+，同时还发现传统的HBV-DNA载量、ALT和AST水平在HBV相关性肝病中差异均无统计学意义，说明这些指标对分析HBV相关性肝病进展有一定的局限性。但是本研究无法进一步说明VEGF、TK-1与CD4+/CD8+变化的内在关系，有待后续动物模型或体外细胞实验证明。