双氢青蒿素通过调节Th17/Treg平衡改善银屑病小鼠皮损机制研究

江从军，周艳梅

银屑病是一种常见的慢性皮肤病，除了累及皮肤外，合并症的风险也很高，包括银屑病关节炎、克罗恩病、恶性肿瘤、肥胖症和心血管疾病，对病人的生活质量造成重大影响[1]。虽然银屑病的发病机制仍未完全阐明，但Th17细胞已被认为在银屑病免疫炎症中起关键作用[2]；相反，调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)主要负责抑制免疫炎症反应，其数量和功能缺陷也参与银屑病的发病[3-4]。双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)近年来备受关注，具有强大的药用价值，其对自身免疫性疾病和肿瘤的治疗具有强效作用，且无明显不良反应[5]。DHA抑制MRL/lpr狼疮小鼠脾细胞中Toll样受体4信号转导通路的激活和Ⅰ型干扰素和抗ds-DNA的产生，以改善狼疮性肾炎的病理损伤[6]。DHA通过调节哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian marget of rapamycin,mTOR)途径下调Th17细胞，上调Treg细胞，从而抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE) 的发生[7]。此外，DHA衍生物DC32通过抑制 IL-6 恢复Th17/Treg平衡，从而抑制类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA) 滑膜炎中的免疫系统失衡和淋巴细胞浸润[8]。然而，DHA对银屑病的作用鲜有报道。基于以上研究，我们推测DHA对银屑病具有治疗作用，并基于Th17/Treg平衡角度初步探讨DHA调控银屑病的作用机制，为银屑病提供新的治疗药物。

1 材料与方法

1.1 材料 BALB/c小鼠(雌性，18～20 g，6～8 周龄)购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司；咪喹莫特(imiquimod,IMQ)乳膏(H20030129)购自四川明欣药业有限公司；DHA(71939-50-9)、羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulos，CMC-Na)(9004-32-4)购自MCE公司，PMA/Ionomycin Mixture(CS1001)、BFA/Monensin Mixture(CS1002)购自联科生物技术有限公司；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；流氏细胞术所需抗体PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 Antibody(100220)、FITC anti-mouse CD4 Antibody(100406)、APC anti-mouse CD25 Antibody(101910)、PE anti-mouse FOXP3 Antibody(126404)、PE anti-mouse IL-17A Antibody(506904)购于美国Biolegend公司；anti-Ki67 Antibody (ab16667)购自ABcam公司；小鼠淋巴细胞分离液及ELISA试剂盒购自于深圳达科为生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分组及药物干预 将24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组6只：空白对照组(Control 组)、模型组(Model组)、25 mg/kg DHA治疗组(DHA-L组)、50 mg/kg DHA治疗组(DHA-H组)。所有小鼠用剃须刀剔除背部毛发(2 cm×3 cm)，然后用脱毛膏进一步去除残余毛发，饲养1 d后开始造模，Model组和DHA治疗组每天脱毛区域给予62.5 mgIMQ外涂，Control组给予等量的白凡士林外涂。DHA溶解于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，分别配成终浓度为2.5 mg/mL和5 mg/mL，现配现用，以防沉淀。各组小鼠均灌胃给药，外涂IMQ或凡士林前1 h给药，每只小鼠灌胃体积为10 mL·kg-1·d-1，Control组和Model组灌胃相应体积的0.5%CMC-Na溶液，连续给药6 d。参照银屑病面积严重程度指数(psoriasis area severity index,PASI)对鳞屑、红斑和皮肤厚度进行评分[9]，计算PASI累积评分，以反映皮损的严重程度，评分范围为0～12分。在连续6 d DHA治疗后的第7天实验结束时，对所有动物腹腔注射巴比妥麻醉，眼眶采血后脱颈椎处死。

1.2.2 HE染色观察皮肤病理改变 用眼科剪小心获取小鼠皮肤，制成石蜡切片，常规HE染色。使用Olympus显微镜观察拍照，测量表皮厚度，并采用银屑病病理(Baker)评分系统进行评分[10]。

1.2.3 免疫组织化学染色Ki67观察表皮增生情况 首先用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)缓冲液修复皮肤组织石蜡切片，并在3%过氧化氢溶液中孵育；切片与一抗anti-Ki67 Antibody在4 ℃的潮湿室中孵育过夜；冲洗后，切片与二抗(HRP-山羊抗兔IgG)孵育1 h，然后二氨基联苯胺显色。为了定量分析Ki67阳性细胞，每张切片在光学显微镜视野下使用Olympus显微镜随机取每个样品的3个区域进行拍照，使用ImagePro Plus 6软件计数表皮基底层Ki67阳性细胞的数量(不计数毛囊中的Ki67阳性细胞)。

1.2.4 流式细胞术检测Th17细胞和Treg细胞比例 采用小鼠淋巴细胞分离液分离获取脾淋巴细胞。取1×106个脾淋巴细胞用于Treg细胞检测；另取1×106个脾淋巴细胞加入24孔版中，每孔体积约1 mL，分别加入PMA/Ionomycin Mixture和BFA/Monensin Mixture各4 μL，置于37 ℃、5%CO2的培养箱培养6 h，用于Th17细胞检测。之后进行小鼠脾淋巴细胞染色，按照说明书先加入PE/Cyanine7 anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4和APC anti-mouse CD25抗体进行表面染色，固定破膜后加入PE anti-mouse IL-17A 或PE anti-mouse FOXP3抗体进行细胞内染色，上机检测后使用 FlowJo 10软件分析数据。

1.2.5 ELISA检测血清细胞因子 小鼠麻醉后摘取眼球取血，室温静置30 min后，4 ℃、2 000 r/min离心获取血清。血清IL-17A和TNF-α通过商品化ELISA试剂盒测定。

1.3 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 各组小鼠6 d后PASI评分比较 Control组小鼠皮肤外观正常，Model组小鼠出现红斑、鳞屑和皮肤增厚，DHA治疗后皮损改善(见图1)；治疗6 d后，DHA-L和DHA-H组的评分均明显低于未用DHA的Model组(P<0.05)(见表1)。

表1 各组小鼠6d后PASI评分比较

2.2 各组小鼠组织病理学表现及表皮厚度、Baker评分及表皮Ki67阳性细胞数比较 组织病理学分析显示，与Control组相比，Model组小鼠的表皮增厚、角化过度、表皮突延长、毛细血管扩张和充血以及细胞浸润明显增多。与Model组小鼠相比，接受DHA治疗的小鼠皮肤病理逐渐恢复，表皮厚度和Baker评分下降(P<0.05)；此外，免疫组织化学染色显示，与 Model组小鼠相比，DHA-L组和DHA-H组表皮Ki67阳性细胞均减少(P<0.05)(见图2、表2)。

表2 各组小鼠表皮厚度、Baker评分及表皮Ki67阳性细胞数比较

2.3 各组小鼠脾Th17 细胞和Treg细胞比例比较 与Control组相比，Model组小鼠脾Th17细胞比例升高(P<0.05)，DHA治疗降低了Th17细胞比例，DHA-L和DHA-H组均较Model组降低(P<0.05)；与Model组相比，DHA-L组和DHA-H组小鼠脾Treg细胞比例升高(P<0.05)(见表3)。

表3 各组小鼠脾Th17 细胞和Treg细胞比例比较

2.4 各组小鼠血清IL-17A和TNF-α水平比较 与Control组相比，Model组血清IL-17A和TNF-α水平均升高(P<0.05)；与Model组相比，DHA-L组和DHA-H组血清IL-17A水平均降低(P<0.05)，而DHA-H组血清TNF-α水平降低(P<0.05)(见表4)。

表4 各组小鼠血清IL-17A和TNF-α水平比较

3 讨论

银屑病是一种常见的慢性皮肤病，确切病因仍未完全了解，但有证据表明它是一种自身免疫性疾病[11]。银屑病的传统治疗主要包括免疫抑制剂，如甲氨蝶呤和环孢素。然而，传统的免疫抑制药物可能会引起各种不良反应，包括肾毒性、肿瘤和感染[12]。最近，生物治疗包括抑制IL-17和其他促炎细胞因子的抗体，已被证明比传统的免疫抑制剂更有效[13]。不幸的是，它们也比传统药物贵得多,而且也存在较高的感染风险[14-15]。因此，需要寻求一种有效、安全且廉价的药物来治疗这种慢性皮肤炎症。青蒿素是一种从中草药青蒿中分离出的活性成分，几十年来一直用于治疗疟疾。由于青蒿素的溶解性差和半衰期短，研究人员开发了其具有更好生物利用度的衍生物。DHA是青蒿素的衍生物，比青蒿素具有更好的生物利用度[16]，在实验动物模型中已证实对脑脊髓炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮等炎症性疾病具有免疫抑制作用[7,17-18]。尽管DHA改善自身免疫性疾病的机制在很大程度上仍然未知，但现有的研究表明其作用机制主要包括抑制氧化应激和NF-κB炎症通路以及通过调控 mTOR 信号转导调节Th17/Treg平衡[7,16,19]。本研究首次证明DHA可以通过调节Th17/Treg 平衡改善IMQ诱导的银屑病小鼠皮损。

本研究中，为了确定DHA是否会改善银屑病小鼠皮肤炎症，我们建立了IMQ诱导的银屑病小鼠模型。未涂抹IMQ的对照小鼠皮肤正常，没有任何炎症或病变迹象，而模型组小鼠皮肤表现出与银屑病外观高度相似的红斑、鳞屑和皮肤增厚迹象，皮肤组织病理也与银屑病组织病理学特征相一致，而这些特征在正常对照组小鼠中没有出现。用低剂量或高剂量DHA治疗均可减轻皮肤病变的严重程度，减少红斑、鳞屑和皮肤厚度，组织病理角化过度和角化不全减少，表皮厚度变薄，与CHEN等报道结果一致[20]。角质形成细胞的增生和分化异常是银屑病的重要病理改变。因为Ki67在细胞周期进展的所有活跃阶段都表达，但在静息阶段(G0)不表达，它经常被用作细胞增殖的标志。为了确定DHA是否可以改善角质形成细胞的过度增殖，采用免疫组织化学染色的方法检测小鼠表皮Ki67蛋白表达水平。结果表明，DHA治疗可以明显减少小鼠表皮中Ki67阳性细胞数，证明DHA确实可以通过抑制角质形成细胞的增殖达到治疗银屑病的作用。

已经证实DHA可以通过调节Th17细胞及其相关细胞因子的产生从而防止EAE的发生[9]。Th17细胞参与了IMQ诱导的银屑病小鼠皮损的形成，为了评估DHA 治疗是否影响银屑病中的Th17细胞，本研究检测了DHA治疗前后银屑病小鼠脾Th17细胞比例，发现DHA治疗能降低银屑病小鼠脾脏中Th17细胞的比例。这些发现表明DHA确实抑制了银屑病小鼠Th17细胞的生成，与LIU等的研究结果相一致[21]。与Th17细胞的促炎作用不同，Treg细胞具有抗炎作用，其数量或功能异常导致不能有效抑制炎症[22],通过恢复其数量或功能有望发挥抗银屑病的作用，常见的免疫抑制剂甲氨蝶呤已被证明有此作用[23]。 Treg细胞在IMQ诱导的银屑病小鼠模型中同样发挥重要的作用，其可以通过抑制γδT细胞以及IL-17A和TNF-α来发挥抗银屑病的作用，去除Treg细胞明显加重了银屑病小鼠的症状[24]。因此，我们探讨了DHA是否会通过上调Treg细胞来发挥其对银屑病的治疗作用。我们通过流式细胞术分析检测了小鼠脾脏中Treg细胞比例，发现DHA增加脾脏中Treg细胞的比例。研究[25]发现，DHA在炎症性肠病小鼠模型中可以通过上调Treg细胞发挥抗炎作用。因此，在我们的研究中，DHA通过增加Treg细胞数量来减轻银屑病皮肤损伤和炎症也很正常。DHA促进Treg细胞生成的确切机制仍有待未来研究确定,先前的研究表明，DHA可能通过抑制mTOR信号转导诱导Treg细胞的表达[7]；DHA也有可能通过抑制促炎细胞因子的表达来维持 Treg细胞的数量，因为一些促炎细胞因子，如 IL-6，会影响FOXP3 的表达[8]。本研究没有对其机制做进一步的研究，这也是笔者未来将要研究的内容。总之，我们的研究结果首次证明，DHA不仅可以抑制Th17细胞，也可以通过上调Treg 细胞的途径，达到治疗银屑病皮损的目的。

IL-23/Th17 通路是银屑病发病机制的关键轴，IL-17A 是该通路的主要效应物，IL-17A 的过度表达会导致表皮过度增生和强烈的炎症反应，从而导致银屑病皮疹和全身炎症，靶向抗IL-17A疗法已证明可有效治疗银屑病[26]。LIU等[21]研究发现，DHA可以降低银屑病小鼠皮肤炎症因子IL-17A、IL-23的表达，也可以降低小鼠脾脏Th17细胞的数量，认为DHA可以通过调控IL-23/TH17轴减轻银屑病小鼠的皮损。本研究在此基础上，进一步检测DHA治疗后银屑病小鼠血清IL-17A的表达，发现血清中的IL-17A也是降低的。TNF-α也是银屑病发病机制中重要的炎症因子，针对TNF-α的生物制剂在银屑病的治疗中取得了非常好的疗效[27]。本研究发现，DHA也可以通过抑制血清中的TNF-α的水平来发挥治疗银屑病的作用。

综上所述，本研究发现DHA通过改善银屑病小鼠皮损、抑制表皮增生、抑制促炎细胞因子如IL-17A和TNF-α的表达，对银屑病发挥有效的抗炎和治疗作用。本研究还发现DHA可以增加IMQ诱导的银屑病小鼠脾脏Treg细胞的数量，同时降低银屑病小鼠脾脏Th17 细胞的数量。本研究为DHA治疗银屑病提供了实验依据。