利拉鲁肽通过AMPK/mTOR信号通路诱导自噬改善肝脂肪变性

李 娟，徐家新，王 春，邵 晨，周路路

非酒精性脂肪肝(NAFLD)与胰岛素抵抗、糖尿病、代谢综合征和心血管疾病发病密切有关[1]，严重时可能发展为肝硬化、肝癌。生活方式干预为治疗的首选，目前仍缺乏较为有效的治疗药物。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种由小肠L细胞分泌的具有刺激胰岛素分泌功能的激素，能调节食物摄入、胃肠蠕动、体液稳态和脂质代谢，刺激细胞增殖，减少炎症和细胞凋亡[2]。利拉鲁肽(LG)是GLP-1的类似物，2009年首次获得许可用于肥胖2型糖尿病(T2DM)病人的血糖控制。LG具有抑制中枢食欲、延迟胃排空时间和诱导剂量依赖性体质量减轻的特性，以往的研究表明LG可以通过非减肥的方式减轻高脂饮食(HFD)诱导的肝脏脂质积聚[3]。LG成为NAFLD病人考虑的一种有希望的治疗选择，然而，LG对NAFLD影响的机制尚不清楚。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是调节自噬的主要通路[4]，激活AMPK / mTOR通路调控自噬是一种重要的保护机制[5]。研究[6]表明，LG可以减轻肝脏脂肪变性，减少氧化应激，并激活自噬。LG除了改善T2DM和NAFLD病人的血糖控制外，还能降低体质量、肝内脂肪和内脏脂肪含量[7]。本研究基于AMPK/mTOR通路探讨LG在肝细胞脂肪变性的影响，观察自噬调节蛋白的变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 LG为诺和诺德(中国制药有限公司生产；AMPK抑制剂(Compound C)购于英国Abcam公司；免疫染色固定液、一抗、二抗、RIPA 裂解液、Western 转膜液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒和SDS-PAGE电泳液均购于碧云天生物技术研究所；PBS缓冲液购于以色列BI生物公司；胎牛血清购于美国GIBCO公司；全自动生化分析仪购于美国贝克曼公司；普通显微镜购于日本Nikon公司；荧光显微镜购于日本OLYMPUS公司；组织包埋机(EG11508)、石蜡切片机(RM2135)购于德国Leica公司；Western blotting用电泳槽(DYCZ-24DN)、转移电泳仪(DYCZ-24DN)及恒温循环器(WD-9412A)、制冰机(SIM-F124)均购于北京六一生物科技有限公司。

1.2 实验分组

1.2.1 动物分组 SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，购于北京维通利华有限公司，7～8周龄，体质量(25.2±3.5)g。将小鼠随机分为对照组(n=10)、模型组(n=10)和LG组(n=10)，后2组应用高脂饲料(脂肪56.0%、蛋白质7.0%、糖类37.0%)喂养建立肝脂肪变性模型，对照组应用普通饲料(脂肪10.2%、蛋白质23.3%、糖类66.5%)喂养。12周后，LG组应用LG腹腔注射0.6 mg·kg-1·d-1，其他2组应用等量0.9%氯化钠溶液，连续用药4周。

1.2.2 细胞培养及分组 应用含0.3 mmol/L棕榈酸(PA)的培养基培养24 h诱导建立HepG2肝细胞脂肪变性模型后，将细胞等量分为模型组(PA)、LG组(PA+LG)和AMPK抑制剂组(PA+LG+Compound C)。LG组加入100 nmol/L LG，AMPK抑制剂组加入100 nmol/L LG和Compound C 20 μmol/L。待细胞长满后进行实验。

1.3 动物实验

1.3.1 血清生化检测 小鼠禁食、禁水12 h，10%水合氯酸麻醉后，摘取双眼球取血，3 000 r/min离心25 min，于-80 ℃保存。应用全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)。

1.3.2 HE染色 石蜡切片，常规脱蜡。苏木精染色、浸洗、1%盐酸与乙醇混合溶液浸泡、流水冲洗返蓝、蒸馏水过洗、5%伊红染色，最后脱水、透明、封片。显微镜观察肝细胞组织形态和脂肪变性。

1.3.3 油红O染色 冰冻切片，蒸馏水充分洗涤，油红O染色10 min。乙醇分化，蒸馏水洗1～2 s，苏木素复染核，蒸馏水洗1～2 s，封片。显微镜观察肝细胞内脂质沉积的情况。

1.3.4 Western blotting方法检测p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Beclin1的蛋白表达 提取肝脏总蛋白后，通过BCA法测定蛋白质浓度。按照比例加入5×电泳加样缓冲液并置于沸水浴中10 min。按每孔30 μg蛋白量上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳(浓缩胶80 V/40 min，分离胶110 V/60 min)，结束电泳后，将分离的蛋白转膜至PVDG膜(300 mA)，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗4 ℃过夜，洗膜后加入二抗，室温孵育1 h洗膜，应用ECL试剂盒显影，并进行统计分析。

1.4 细胞实验

1.4.1 免疫荧光法检测LC3B的表达 将贴壁的HepG2细胞胰酶消化后制成细胞悬液，将无菌细胞爬片放置于六孔板底部后滴加500 μL细胞悬液，置于5%CO2细胞培养箱孵育2 h使HepG2细胞贴于细胞爬片上；每孔加1 200 μL 2%FBS培养基，继续孵育8 h。爬片后，双氧水孵育30 min，含有Tween-20的3%牛血清白蛋白/ PBS 缓冲液封闭2 h，一抗过夜孵育，再用 PBS 缓冲液清洗2次。二抗孵育 30 min，用PBS 缓冲液清洗2次，再用 1 μg/mL DAPI 复染。所有的操作步骤都在室温下进行。在100×的油镜下使用荧光显微镜观察并采集图像。

1.4.2 Western blotting方法检测p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Beclin1蛋白表达 提取细胞总蛋白，按照1.3.4的实验方法检测HepG2细胞p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Beclin1的蛋白表达。

1.5 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 动物实验结果

2.1.1 血清生化结果 结果显示，3组之间总体均数差异有统计学意义，其中模型组与对照组比较，小鼠血清ALT、AST、LDL、TC、TG升高;LG组与模型组相比，血清ALT、AST、LDL、TC、TG下降，差异具有统计学意义(P<0.05～P<0.01)(见表1)。

表1 各组小鼠ALT、AST、LDL、TC、TG比较

2.1.2 HE染色结果 结果显示，对照组小鼠肝细胞排列规则、细胞核清晰、细胞质均匀、基本无脂肪变性，模型组肝细胞排列紊乱、细胞膨胀、可见大量脂肪空泡形成，LG组较模型组相比，肝细胞排列较其整齐，脂肪空泡明显减少。说明LG能改善肝细胞脂肪变性(见图1)。

2.1.3 油红O染色结果 结果显示，对照组小鼠肝组织细胞中偶见橘黄色脂滴，高脂喂养后模型组小鼠肝组织细胞可见大量橘黄色脂滴，融合成片，而LG干预后脂滴含量明显减少(见图2)。

2.1.4 Western blotting检测结果 结果显示，与对照组相比，模型组p-AMPK、LC3B、Beclin1的蛋白表达下降，p-mTOR表达升高；而LG组与模型组相比，p-AMPK、LC3B、Beclin1的蛋白表达水平均升高，p-mTOR表达下降，差异均有统计学意义(P<0.05～P<0.01)(见图3、表2)。

表2 各组小鼠肝细胞内p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Baclin1蛋白水平的比较

2.2 细胞实验结果

2.2.1 免疫荧光检测LC3B结果 结果显示，模型组HepG2细胞可见极少量的LC3B的表达，LG组细胞内LC3B的表达较模型组升高，而AMPK抑制剂组LC3B的表达较LG组减少(见图4)。

2.2.2 Western blotting法检测结果 结果显示，和模型组相比，LG组p-AMPK、LC3B、Beclin1的蛋白表达升高，而应用AMPK抑制剂Compound C后上述指标表达较LG组受抑制下降(P<0.05～P<0.01)；此外，和模型组相比，p-mTOR在LG组表达降低，应用AMPK抑制剂Compound C后表达较LG组增加，差异均有统计学意义(P<0.05～P<0.01)(见图5、表3)。

表3 各组HepG2细胞p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Baclin1蛋白水平的比较

3 讨论

一项针对中国人群的分析数据显示[8]，我国NAFLD的患病率达29.2%。NAFLD为糖尿病、心血管疾病的高危因素[9-10]，T2DM病人中49%～62%的人群合并有NAFLD，肥胖T2DM病人中NAFLD的患病率高达70%。NAFLD主要的病理演变过程为肝脏脂肪变性、肝细胞炎性改变严重发生肝细胞坏死。因此，延缓NAFLD进展，改善肝细胞脂肪变性，受到了人们的广泛重视。

LG作为长效GLP-1类似物，不仅具有GLP-1降脂、减重、降压等作用[11-12]，而且在保留其生物活性的情况下延长了半衰期[13]，在2型糖尿病和心血管疾病的防治上有明确的优势。有研究[14]表明GLP-1受体激动剂可改善肝细胞内脂质沉积，发挥降脂的作用。HAO等[15]研究发现，HFD诱导的脂肪性肝炎(NASH)小鼠体质量增加，肝脂肪水平增加。LG治疗后可显著降低HFD喂养小鼠的体质量，改善肝脏脂质蓄积，抑制血清总胆固醇和LDL水平的升高。我们的研究显示，应用HFD喂养构建立肝脂肪变性的小鼠模型，发现HFD喂养的小鼠血脂升高、肝功能明显损坏，而LG能改善这一情况。HE染色和油红染色进一步观察发现肝脂肪变性的小鼠肝细胞排列紊乱、细胞膨胀、可见大量脂肪空泡形成和炎性浸润，肝组织内出现大量脂滴，而应用LG后脂肪空泡、脂滴明显减少。以上说明，LG可以改善高脂诱导的肝细胞脂肪变性，抑制肝细胞脂质沉积。

自噬是细胞自我更新的过程，分为选择性自噬和非选择性自噬。选择性自噬是细胞特异性的吞噬低能的细胞器，例如线粒体受损，细胞内脂质过量。LC3B作为自噬小体形成过程中的招募蛋白存在于自噬小体的膜上，可以追踪自噬的形成；Beclin1是哺乳动物自噬过程的特异基因，不参与自噬泡形成，是一种自噬相关调节蛋白。自噬激活后自噬体形成，可与溶酶体融合后释放的酸性脂肪酶将脂质进行降解。自噬与脂质代谢、胰岛素抵抗的相关性在很多研究中报道，自噬可以促进肝细胞中脂类物质的降解,减少其在肝脏的集聚，最终改善脂肪变性[16]。ZHANG等[17]通过小鼠体内实验证明，通过营养缺乏诱导自噬激活，刺激LC3B与脂滴的结合，介导肝细胞内脂滴的降解，自噬增强可以保护肝细胞。长期HFD导致体内游离脂肪酸(FFA)增加，肝细胞自噬减弱，脂质蓄积最终形成脂肪肝。近期研究显示，LG可以改善FFA 诱导的脂毒性肝细胞损伤，并通过促进细胞自噬来改善NAFLD中肝细胞脂肪变性[18]。 LG可以诱导HFD小鼠自噬，也可以通过增强自噬通量减轻PA诱导的脂质积聚[19]。本研究无论动物实验还是细胞实验结果均显示LG应用后与模型组比较，自噬蛋白LC3B、Beclin1表达均明显增多，初步探讨了自噬在LG改善肝细胞脂肪变性的作用。

mTOR是自噬主要抑制通路之一，是AMPK下游信号分子。AMPK的激活会使Beclin1发生磷酸化，促进自噬的发生和发展。AMPK是自噬的经典上游调节剂，能被GLP-1R激动剂激活。有研究[20]显示AMPK是通过抑制肝脏细胞新生脂肪产生、增加肝脏脂肪酸的氧化能力、保护肝脏脂肪组织中线粒体功能这3种方式改善NAFLD肝脏脂肪变性。AMPK/mTOR介导的自噬水平在高脂喂养的小鼠及游离脂肪酸处理的LO2 细胞(人正常肝细胞)中均有明显抑制作用[21]。小鼠HFD16周后肝脏自噬水平下调，机制考虑与p-AMPK/mTOR信号通路活性抑制相关[22]。以上动物及细胞实验均提示AMPK/mTOR可以诱导自噬改善肝脏细胞脂肪变性，我们的实验Western blotting结果中发现，自噬标志物LC3B等蛋白表达增加，AMPK/mTOR信号通路活化，两者之间呈现一致性改变。应用免疫荧光染色和Western blotting发现模型组自噬的表达很低，LG组明显增高，而AMPK抑制剂Compound C能拮抗LG对自噬的增强作用。最终我们得出结论，肝细胞变性时应用LG所产生的自噬增加与AMPK/mTOR信号通路存在相关性。LG能通过活化AMPK抑制mTOR促进自噬的发生，改善肝细胞脂肪变性。AMPK抑制剂能拮抗这一反应的作用。我们的研究结果有助于为临床应用LG治疗NAFLD及其相关代谢综合征提供证据。