硅酸钠诱导的马铃薯抗黑痣病StWRKY11基因克隆及生物信息学分析

张冬梅，冯亚艳，修志君，杨春芳，杜美娥，李得宙，张笑宇

(1.内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010020；2.内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；3.鄂尔多斯生态环境职业学院 生态工程系，内蒙古 鄂尔多斯 017010；4.内蒙古农业大学 农学院，内蒙古 呼和浩特 010019；5.内蒙古农业大学 发展规划处，内蒙古 呼和浩特 010018)

马铃薯黑痣病(RhizoctoniasolaniKühn)是马铃薯生产中的主要病害。目前主要使用化学防治，而相比于化学防治，诱导抗病性具有长效、不污染环境的特点，已被广大学者关注。硅证实是具有诱导植物抗病性的矿质营养元素[1]，但其抗性机制没有定论，尤其对分子抗病机制研究的很少。WRKY转录因子作为诱导型调节因子，主要功能是激活或抑制特定基因的转录，影响植物体内蛋白质的表达[2]。该转录因子的共同特点是具有1～2个WRKY结构域，结构域C端具有1个C2H2或C2HC的锌指结构[3]。根据结构域数量及锌指结构的类型将其分为3个组，第1组一般包含2个WRKY域，锌指结构模式为CX4-5CX22-23HXH；第2组和第3组一般都只包含1个WRKY域，但第3组仅在组成锌指的氨基酸有变化，为CX7CX22-23HXC[4]。WRKY转录因子通过结合核酸序列的靶基因启动子区域W-box(T)(T)TGAC(C/T)调控相关基因表达[5]，其中TGAC是核心，固定不变[6]，W-box对WRKY转录因子功能的发挥具有不可或缺的作用[7]。W-box主要存在于与植物衰老、逆境胁迫、抵抗病原物等相关的基因区域以及水杨酸等诱导基因的启动子中[8]。

目前，针对WRKY转录因子的研究主要集中在拟南芥、水稻、玉米等已测序的物种上，在马铃薯中的研究起步较晚且较少。马铃薯中已报道82个WRKY转录因子[9]，Dellagi等[10]研究StWRKY1基因可受软腐病诱导表达，该基因可参与马铃薯对软腐病的抗性作用。β-氨基丁酸(BABA)诱导马铃薯体内的StWRKY5基因[11-12]和StWRKY8基因[13]上调表达调控对晚疫病菌的抗性。转录因子WRKY参与马铃薯黑痣病的抗性目前未见相关报道。

有报道，WRKY11基因可参与植物的生物胁迫调控，对拟南芥的研究中，可负调控丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomato，Pst)[14]、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)AR156[15]和甜菜线虫(Betavulgaris)[16]诱导的抗病反应；该基因上调表达可提高烟草对赤星病(Alternariaalternate)的抗性[17]。在水稻[18]、拟南芥[19]、烟草[20]、大豆[21]、毛竹[22]和陆地棉[23]的抗高温、抗旱、抗盐、抗衰老过程中，有报道WRKY11基因可以参与植物的生长发育过程，调控植物对外界不良环境的抵抗能力。马铃薯StWRKY11基因与抗病性方面的相关研究未见报道。

前期明确了硅酸钠增强马铃薯黑痣病菌抗性[24-25]，基于硅酸钠诱导马铃薯黑痣病抗性的转录组信息，选取上调表达量高的StWRKY11。本研究克隆StWRKY11基因，并利用生物信息学网站对该基因及编码的蛋白进行了理化性质、信号肽与跨膜结构、结构域预测、亚细胞定位和基因启动子区顺式作用元件预测等生物信息分析，旨在为研究该基因功能，揭示硅酸钠增强马铃薯黑痣病抗性的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

供试植物材料：马铃薯大西洋(Atlantic)脱毒组培苗，是内蒙古农业大学园艺与植物保护学院植物病理课题组茎尖剥离，病毒检测的无毒组培苗。供试病原菌：立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniAG-3)，是本课题组分离鉴定并对马铃薯具有强致病性的病原菌。供试培养基：PSA培养基、LB培养基、MS固体培养基、MS液体培养液。

供试试剂：Plant RNA Extraction Kit试剂盒、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒、pMD-19T克隆载体、大肠杆菌感受态细胞DH5α、2 000 bp DNA Marker均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Easy Taq DNA Polymerase、dNTPS、10×Easy Taq Buffer和琼脂糖购自全式金试剂公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(PD209-02)及质粒小提试剂盒(PD103-02)购自天根生化科技(北京)有限公司；氨苄抗生素购自北京索莱宝科技有限公司；其他化学试剂均购于国内试剂公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 将马铃薯黑痣病菌置于PSA培养基上28 ℃培养5 d，将培养基和病原菌一起用组织捣碎机捣碎，加水稀释成浓度为1.0×107个菌丝段/cm3的菌丝悬浮液，作为病原菌接种体。将在MS培养基上培养17～18 d的马铃薯大西洋脱毒组培苗，移栽至盛有400 g左右无菌蛭石的直径18 cm、高20 cm的花盆中，每盆5株，共12盆。每7 d浇1次MS营养液，每次500 mL，培养30 d施硅酸钠并接菌，即浇入含NaSiO3·9H2O(浓度为3.02 g/L)的MS营养液500 mL，同时将病原菌接种体接种至马铃薯幼苗地上茎基部向下约3 cm处，每株接种3 mL，以接菌不施硅酸钠为对照，于生长季在内蒙古农业大学农场室外培养，处理4 d对马铃薯幼苗的地下茎取样，将样品用液氮冷冻，置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.2 马铃薯StWRKY11基因克隆

1.2.2.1 马铃薯地下茎RNA提取及cDNA合成 利用 Plant RNA Extraction Kit试剂盒提取处理4 d的马铃薯地下茎总RNA，检测其完整性、浓度和纯度；利用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒将其合成第一链cDNA，于-20 ℃保存备用。

1.2.2.2StWRKY11基因扩增 以转录组数据中StWRKY11基因ORF序列为模板，利用Primer Premier 5.0设计引物，上游引物：5′-ATGGCTGTAGATTTGTTAAATTATTCG-3′；下游引物：5′-CTAAATCTCTAACCCTAATCGTTCTCC-3′。反应体系为25 μL，包括17.5 μL RNase Free dH2O，1.0 μL cDNA，0.5 μL EasyTaqDNA Polymerase，1.5 μL dNTPs Mix，2.5 μL 10×Easy Taq Buffer，上下游引物各1.0 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。利用天根琼脂糖凝胶(DNA)纯化试剂盒对目的片段进行回收纯化，用Nanodrop检测其浓度和纯度。

1.2.2.3StWRKY11基因克隆载体构建 将PCR胶回收产物连接到pMD19-T克隆载体上，连接反应体系为10 μL，包括4.0 μL胶回收产物DNA，1.0 μL pMD-19T，5.0 μL Solution Ⅰ，反应条件为16 ℃连接1 h。将重组连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，再于37 ℃恒温培养14 h，在 LB(Amp+) 培养基上筛选阳性克隆菌落，挑取单克隆菌落在LB(Amp+)液体培养基，于37 ℃、180 r/min恒温摇床振荡培养12 h。利用1.2.2.2中StWRKY11基因特异性引物将阳性克隆DH5α大肠杆菌菌液进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，选取具有明显电泳条带的阳性克隆菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，结果通过DNAMAN进行序列比对，确定目的基因成功连入克隆载体。利用天根质粒小提试剂盒对测序结果一致性高的菌液进行重组质粒提取，并用Nanodrop检测其浓度和纯度。

1.2.3StWRKY11基因的生物信息学分析 根据已有的StWRKY11基因序列，翻译获得该蛋白质的氨基酸序列，利用NCBI数据库ORF Finder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)获得开放阅读框并分析；运用ExPASy网站中的ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/) 对蛋白质的理化性质进行预测；通过 ExPAsy-ProtScale(http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) 在线分析蛋白质的亲水性和疏水性；利用TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SignalP 4.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对蛋白质进行跨膜结构域分析和信号肽分析；利用NetPhos 2.0 Server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)预测蛋白质的磷酸位点；蛋白质的二级结构通过SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在线进行预测分析；利用Wolf PSORT Ⅱ软件(https://wolfpsort.hgc.jp/)和Softberry(http：//www.softberry.com/berry.phtml?topic=promoter)预测蛋白质亚细胞定位；利用 Phyre(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html) 预测蛋白质的三级结构建模；利用PLACE网站(https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)对StWRKY11基因启动子区顺式作用元件预测；运用NCBI 的Blast选取与该基因编码的蛋白质同源性较高且已有研究的其他物种的蛋白质氨基酸序列(表1)，运用MEGA 7.0构建系统进化树。

表1 不同物种的WRKY蛋白质氨基酸序列Tab.1 Amino acid sequences of WRKY proteins in different species

2 结果与分析

2.1 马铃薯StWRKY11基因的克隆

2.1.1StWRKY11基因扩增检测结果 提取马铃薯地下茎总RNA，并反转录得到cDNA，以cDNA为模板，StWRKY11-F和StWRKY11-R为上下游引物，经PCR扩增，利用1.0%琼脂糖电泳检测，结果显示，在1 000 bp处有清晰的电泳条带(图1)，且周围没有杂带，与预测的StWRKY11基因的大小1 005 bp基本吻合。该基因序列已提交NMDC，登录号为NMDCN0000N91。

M.DL2000 Marker；1—2.StWRKY11扩增片段。M.DL2000 Marker；1—2.StWRKY11 amplified fragments.

2.1.2StWRKY11基因克隆载体构建StWRKY11基因扩增产物和pMD19-T克隆载体连接，转化DH5α大肠杆菌后的菌液PCR扩增结果显示(图2)，在1 000 bp处有清晰的电泳条带，序列比对的结果显示，相似度为97.41%，基因的CDS序列长度为1 005 bp，说明StWRKY11基因被成功连接到克隆载体上。

M.DL2000 Marker；1—3.StWRKY11基因克隆扩增片段。M.DL2000 Marker；1—3. StWRKY11 gene clone amplified fragment.

2.2 StWRKY11基因的生物信息学分析

2.2.1StWRKY11基因编码的蛋白质理化性质及亲疏水性分析 通过NCBI数据库中ORF Finder对StWRKY11基因的开放阅读框进行分析，结果表明，该基因编码334个氨基酸，且含有锌指结构CX5CX23HXH(图3)。利用ProtParam网站对StWRKY11基因表达蛋白质理化性质进行预测，结果表明，其分子式为 C3013H5023N1005O1260S199，分子质量为81.867 94 ku，理论等电点(pI)为5.09，原子总数为10 500，脂肪族氨基酸指数为29.45，蛋白质的半衰期为10 h，不稳定指数为33.71(小于40)，因此将其归类为稳定蛋白质。

图3 StWRKY11基因的碱基序列及其表达蛋白质氨基酸序列Fig.3 Sequence of StWRKY11 gene and amino acid sequence of its expressed protein

利用ExPAsy网站中ProtParam和ProtScale，结合分析蛋白质的疏水性和亲水性表明，该基因编码的蛋白质亲水性平均值(GRAVY)为 0.746，在多肽链上最大值的异亮氨酸(Ile)为4.500，疏水性最强；最小值的精氨酸(Arg)为-4.500，亲水性最强，StWRKY11基因编码的亲水性氨基酸小于疏水性氨基酸，推测该蛋白为疏水性稳定蛋白(图4)。

图4 StWRKY11基因表达蛋白质亲水性/疏水性分析Fig.4 Hydrophilic/hydrophobic analysis of StWRKY11 gene expressed proteins

2.2.2StWRKY11基因表达蛋白质跨膜结构域及信号肽预测 利用TMHMM Server v.2.0网站分析StWRKY11基因表达蛋白质跨膜区分布，结果表明(图5)，该蛋白质没有跨膜分布，不是一个膜结合蛋白质。通过SignalP 4.1 Server分析蛋白质信号肽，显示其不含有N端信号肽，该蛋白质无信号肽，为非分泌蛋白质。

图5 StWRKY11基因表达蛋白质跨膜区分析Fig.5 Transmembrane region analysis of StWRKY11 gene expression protein

2.2.3StWRKY11基因表达蛋白质磷酸化分析 利用NetPhos 2.0 Server分析StWRKY11基因编码的蛋白磷酸化位点，结果显示，共有29个磷酸化位点，其中有3个苏氨酸(Thr)磷酸化位点分别在第97，127，277位氨基酸上；4个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点分别在第55，117，239，244位氨基酸上；22个为丝氨酸(Ser)磷酸化位点，说明该蛋白能够参与细胞内的生长分化以及信号转导等多种生命活动。

2.2.4StWRKY11基因表达蛋白质二级结构预测及亚细胞定位分析 利用SOPMA网站对StWRKY11基因编码的蛋白质二级结构进行分析，结果显示，该蛋白质二级结构由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角4种结构形式组成，其中无规则卷曲(Cc)占比最高，达61.68%，无规则卷曲可连接其他二级结构原件；而其他二级结构相对较少，α-螺旋(Hh)占16.77%，延伸链(Ee)占13.17%，β-转角(Tt)占8.38%，这些结构散布于整个蛋白质中(图6)。利用Wolf PSORT Ⅱ软件和Softberry网站对该蛋白质亚细胞定位进行推测，其可能定位到细胞核中。

蓝色.α螺旋；红色.延伸链；绿色.β-折叠；黄色.无规则卷曲。Blue.α-helix；Red.Extended chain；Green.β-folding；Yellow.Random coiling.

2.2.5StWRKY11基因表达蛋白质三级结构预测 通过Phyre网站对StWRKY11基因编码的蛋白质三级结构进行分析，结果显示，该模型未形成多聚体和配体结构，且与拟南芥AtWRKY1基因编码的蛋白质相似性最高，达55%(图7)。

图7 StWRKY11基因表达蛋白三级结构预测Fig.7 Prediction of tertiary structure of StWRKY11 gene expressed protein

2.2.6StWRKY11基因启动子区顺式作用元件预测 利用网站PLACE分析StWRKY11基因启动子上游的顺式作用元件可见(表2)，启动子上游区域含有转录因子固有的核心元件CAAT区(CAAT-box)和TATA区(TATA-box)；逆境胁迫相关的顺式作用元件，铜响应元件(CURECORECR)、MYB顺式元件(MYB2AT)、DNA结合蛋白调控元件(DOFCOREZM)、转录激活元件(ARR1)、CGCG区(CGCG-box)和W-区(W-box)；植物生长发育相关的顺式作用元件，GATA区(GATA-box)、光调控顺式元件(GT1CONSENSUS)、ARE调控元件(ARE)、叶肉特异基因表达调控元件(CACTFTPPCA1)、花粉调控元件(GTGANTG10)和脱水顺式元件(CBFHV)；激素响应相关的作用元件，赤霉素调控元件(PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A)、茉莉酸调控元件(ASF1MOTIFCAMV)、脱落酸响应元件(ABRE)。

表2 StWRKY11基因启动子区的顺式作用元件分析Tab.2 Analysis of cis-acting elements in the promoter region of StWRKY11 gene

2.2.7 不同物种WRKY序列比对及聚类分析 马铃薯StWRKY11基因编码蛋白质的氨基酸序列和其他物种比较的结果表明(图8)，不同物种中的WRKY蛋白质氨基酸序列均有一段保守的氨基酸序列，即WRKY转录因子家族所特有的WRKYGQK序列和锌指结构。

图8 StWRKY11基因表达蛋白质与其他物种的WRKY蛋白质氨基酸序列比对Fig.8 The amino acid sequence of StWRKY11 gene expressed protein was compared with that of WRKY protein of other species

通过MEGA7.0软件构建系统进化树可见，StWRKY11基因编码的蛋白质氨基酸序列与马铃薯中的StWRKY5亲缘关系最近，同源性为95%(图9)。

图9 StWRKY11基因表达蛋白质与其他物种的WRKY蛋白质的系统进化树Fig.9 The StWRKY11 gene expresses proteins in a phylogenetic tree with WRKY proteins of other species

3 结论与讨论

植物在受到衰老、干旱和盐胁迫后，会激活水杨酸(Salicylic acid，SA)和茉莉酸(Jasmonic acid，JA)的信号转导途径[18-19]，促进WRKY11基因上调表达，进一步可能通过抑制活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的积累或清除过多的ROS及减少膜损伤等方面提高植物耐受性[26]。当植物受到生物胁迫时，通常会启动茉莉酸和乙烯(ET)的合成途径，从而激活JA/ET信号转导途径，响应抗病转录因子WRKY11的表达，进一步激活下游关键靶基因(如PR5/Gluc/PRB-1b)[23]和抗病相关基因(NPR1、AOS和LOX2)[27]的表达，从而使植株体自身产生对病原菌的抗性。蜡样芽孢杆菌AR156侵染拟南芥时，WRKY11基因受JA抑制表达，以此激发植株产生系统诱导抗病性[21]，张洁等[28]在2017年研究发现，烟草TT8的WRKY11基因受JA诱导表达，同时也受到ET和SA的共同抑制，负调控烟草对黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus)的抗性。本研究通过分析硅酸钠增强马铃薯黑痣病抗性的转录组，筛选到表达量较大基因WRKY11，对该基因进行了克隆，并进一步探讨其功能，期望从分子上阐明硅酸钠诱导马铃薯抗黑痣病的机制。

本研究利用克隆技术获得了马铃薯StWRKY11基因的全长序列，并通过在线软件ORF Finder、ProtParam、TMHMM Server、SignalP 4.1 Server 、NetPhos 2.0 Server、Wolf PSORT Ⅱ、SOPMA和Phyre分析了该基因生物学信息，结果表明，开放阅读框为1 005 bp，编码了334个氨基酸，表达蛋白序列中存在结构为WRKYGQK保守结构域，并含有CX5CX23HXH锌指结构，明确其具有第2类 WRKY的共同结构特征，第2组WRKY蛋白又可以根据锌指基序中C2之间氨基酸的数量和类型进一步分为5个亚组(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd 和Ⅱe)[29]，StWRKY11基因是马铃薯WRKY第2类Ⅱd亚组成员。Ⅱd类WRKY蛋白中保守结构域是可以与钙调素结合的“C motif”，Ca2+能参与植物抗性信号传导[30]，推测Ⅱd类WRKY转录因子可能作为Ca2+受体，通过其“C motif”与钙调素结合，进而响应抗病反应[31]。

WRKY转录因子在参与植物生物学过程中，其活性会受丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)的调控，MAPK、MAPK激酶(MAPKK)和MAPKK激酶(MAPKKK)构成MAP激酶级联放大系统，它能通过一系列的磷酸化反应将外界信号逐步放大并传递至细胞内，从而引起相应的生理生化活动[32-33]，其中磷酸化和去磷酸化都是细胞内信号传导的重要方式，磷酸化也是一种重要的翻译后修饰方式[34]，磷酸化修饰位点与植物细胞的增殖分化、代谢调节等都有密切联系[35]。研究报道，MAPK可作为底物和磷酸化激活植物的WRKY基因表达[36-37]，由此可知，MAPK可能处于WRKY的上游，其功能会受MAPK激酶的修饰[38]。Kim等[38]研究发现，当施用水杨酸和茉莉酸等外源因子诱导烟草时，会与其细胞膜的受体特异识别并结合，激活植株体内的MAPK信号网络通路，MAPK可以通过磷酸化或者去磷酸化将信号传导进入细胞核内，从而激活或抑制WRKY类转录因子的活性。本试验StWRKY11基因编码的氨基酸，共含有29个磷酸化位点，该基因编码蛋白质存在多种表达调控方式，能够参与细胞内的生长分化以及信号转导等多种生命活动，此结果与前人的研究结果相一致[39]。

马铃薯StWRKY11基因表达蛋白的二级结构有4种结构形式：结构元件是α-螺旋、延伸链、β-折叠和无规则卷曲，这为实现其功能提供了空间结构及功能元件。亚细胞定位预测中，StWRKY11基因表达蛋白可能定位于细胞核中，这与以往研究报道中WRKY转录因子始终定位于细胞核内[40]的结果相吻合。StWRKY11基因表达蛋白不具有跨膜结构，StWRKY11无法通过跨膜结构域固定在细胞膜或细胞器膜上，推测StWRKY11通过核孔复合体进入细胞核中[41]，证实了该蛋白定位于细胞核的结果。

Rushton等[42]利用只含W-box转录因子结合元件作为启动子，研究W-box可参与拟南芥对病原体及其他胁迫因子的防卫或胁迫反应，反应程度与W-box的数量及位置有关。本研究中，StWRKY11基因表达蛋白在保守结构域有高度相似性，均含有保守序列(T)TGAC(C/T)(W-box)。推测硅酸钠增强马铃薯黑痣病的抗性可能与保守结构域有关。

StWRKY11基因启动区顺式作用元件预测启动子区有与抗性胁迫响应相关的顺式调控元件，还有与生长发育及赤霉素、脱落酸和茉莉酸等激素响应的顺式作用调控元件，该基因可能既参与马铃薯对黑痣病菌的抗性也参与生长发育相关途径，这也可能为解释硅酸钠增强马铃薯黑痣病的抗性以及增加产量和改善品质的现象提供依据。

马铃薯StWRKY11基因与马铃薯StWRKY5基因表达蛋白在进化树上亲缘关系最近，同源性为95%，该基因在BABA诱导马铃薯提高马铃薯晚疫病(Phytophthorainfestans)抗性时表达，表明该基因参与了马铃薯的抗病反应[43]。结果显示，与其他物种的WRKY蛋白同源性较低，这与其他学者的研究一致，即属内同源性高，属间同源性相对较低[44]。