BYDV GAV编码蛋白质的定位、互作及致病相关功能研究

韩晓玉，李庆伦，姜兴林，王 贺，杨灵玲，史亚娟，李洪连，陈琳琳，杨 雪，施 艳

(河南农业大学 植物保护学院，河南 郑州 450002)

大麦黄矮病毒(Barleyyellowdwarfviruses，BYDVs)可以感染各种禾本科作物，例如小麦(Triticumaestivum)、大麦(Hordeumvulgare)和燕麦(Avenasativa)等[1-2]，对禾本科作物生产造成严重的产量损失[3]，是世界范围内禾本科作物上的重要病毒[4-5]。BYDVs引起的小麦黄矮病是我国小麦生产上重要的病毒病[6]，目前该病毒主要分布在西北、华北、东北、华中、西南及华东等冬麦区、春麦区及冬春麦混种区。小麦感病后植株矮化，叶尖出现倒“V”字形黄化，一般减产10%～20%，严重的可达到50%以上，个别地块甚至可造成绝产。病毒感染会导致宿主植物显示叶片变黄的症状，这种现象通常与叶绿素生物合成功能损害有关，导致光合作用减弱[7-9]。病毒编码蛋白质在病毒侵染过程中发挥重要作用，因此，研究BYDVs编码蛋白质的功能将为后续解析该病毒的致病机制奠定基础。

BYDVs是一组由黄症病毒属、马铃薯卷叶病毒属和未归属的种组成的正单链RNA病毒[3]，通过蚜虫进行持久非增殖型传播，基于蚜虫介体的特异性和病毒的序列，BYDVs可分为10个典型株系，分别为：黄症病毒属的BYDV PAV、PAS、MAV、kerⅡ和kerⅢ株系，马铃薯卷叶病毒属的谷类黄矮病毒(Cerealyellowdwarfvirus，CYDV)RPV和RPS株系，以及玉米黄矮病毒(Maizeyellowdwarfvirus，MYDV)RMV株系和黄症病毒科未归属的BYDV GPV和SGV株系[10-12]。在我国，目前报道的BYDVs株系有4个，分别为：BYDV GPV、GAV、PAV和RMV。其中，BYDV GAV与美国MAV有着相同的血清学反应，全基因组序列一致性最高，为90.4%[10]，但是二者传播介体不同，GAV可以由麦长管蚜和麦二叉蚜传播，MAV仅能通过麦长管蚜传播，因此，GAV是我国特有的一种BYDVs，已成为我国小麦黄矮病的主要病原[13-15]。

BYDVs基因组全长约5.7 kb，5′端无帽子结构，3′端无poly(A)尾，编码7个阅读框，分别为：ORF1和ORF2编码与复制相关的蛋白质P1和P2；ORF3编码外壳蛋白(CP)；ORF4编码移动蛋白(MP)，有研究表明，MP还可以作为沉默抑制子发挥功能[16]；ORF5编码CP通读蛋白，该蛋白质与病毒粒子的稳定性和蚜虫传播有关[17]；ORF6编码P6蛋白，其在黄症病毒中变异较大，目前的研究认为，该蛋白质是BYDV GAV的沉默抑制子蛋白[18]；ORF3a编码P3a蛋白，其是由非AUG起始的一个40～50 个氨基酸的小蛋白质，研究表明，该蛋白质能够影响马铃薯卷叶病毒属芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)的系统移动[19]。

目前，BYDV GAV编码蛋白质MP和P6已有相关研究[18，20]，而有关P1、P2和CP的功能研究较为缺乏，3个病毒蛋白是否通过与其他病毒蛋白协作参与病毒侵染，是否参与病毒的致病过程尚不清楚。鉴于此，本研究对3个蛋白质的亚细胞定位、互作情况和致病相关功能进行研究，分析P1、P2和CP与BYDV GAV编码蛋白质的互作情况和对病毒致病性的影响，旨在为研究该病毒的致病机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

病毒序列来源：BYDV GAV病毒编码蛋白序列来源于河南农业大学植物保护学院土传病害实验室保存的BYDVGAV病毒性克隆质粒。

供试植物：本氏烟(Nicotianabenthamiana)种植于本实验室温室。

菌株与载体：大肠杆菌DH5α感受态细胞及农杆菌GV3101感受态细胞购于庄盟生物公司，保存于-80 ℃冰箱。pEG104载体用于亚细胞定位的观察，pGR106载体即马铃薯X病毒(PotatovirusX，PVX)载体，用于致病因子的测定，cYFP和nYFP载体用于双分子荧光互补(Bimolecular fluorescent complimentary，BiFC)试验。以上载体均保存在本实验室。

1.2 BYDV GAV编码P1、P2和CP蛋白的同源进化分析

在NCBI网站查找BYDVs不同株系BYDV GAV、GPV、PAV和RMV的基因组，将编码蛋白质P1、P2和CP的核苷酸序列进行Blast比对，对同源性高的核苷酸序列采用邻接法(Neighbor joining，NJ)进行系统进化分析。利用Mega 7.0软件建立系统发育树。

1.3 载体构建所用引物的设计

通过DNAMAN软件设计引物，送由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 BYDV GAV编码P1、P2和CP蛋白的亚细胞定位观察

用Gateway方法利用BPBYDVP1F/BPBYDVP1R、BPBYDVP2F/BPBYDVP2R和BPBYDVCPF/BPBYDVCPR分别构建BP-P1、BP-P2和BP-CP中间载体。用中间载体分别和pEG104载体进行LR反应构建P1-YFP，P2-YFP和CP-YFP荧光表达载体，转化农杆菌感受态GV3101，挑取单菌落验证正确后摇菌。将含有P1-YFP、P2-YFP和CP-YFP质粒的农杆菌用MMA缓冲液(10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，200 μmol/L 乙酰丁香酮，pH值5.6)悬浮后，OD600值定为1，静置2 h后浸润健康本氏烟叶片(第7，8片叶)下表皮，接种2 d后在激光共聚焦显微镜(Zeiss 810)下观察本氏烟叶片表皮细胞中YFP荧光，其激发光波长为514 nm。

1.5 BYDV GAV蛋白质互作的BiFC验证

通过BiFC技术可以将具有相互作用亲和力的2个蛋白质组装成完整的荧光蛋白。利用PNCBYDVP1F/PNCBYDVP1R、PNCBYDVP2F/PNCBYDVP2R、PNCBYDVCPF/PNCBYDVCPR、PNCBYDVMPF/PNCBY

DVMPR和PNCBYDVP6F/PNCBYDVP6R等引物分别构建BYDV P1、P2、CP、MP和P6的nYFP和cYFP载体。将构建成功的BYDV P1、P2、CP、MP和P6的nYFP和cYFP载体转化农杆菌感受态GV3101，得到的农杆菌用MMA缓冲液悬浮至OD600值为0.1。将不同编码蛋白质的nYFP和cYFP菌液分别组合，浸润3—4叶期本氏烟，接种2 d后用激光共聚焦显微镜观察荧光并拍摄。

目前，广西各项社会保险费的征缴主要采取社会保险经办机构征收的模式，即由人力资源和社会保障部门社会保险经办机构负责征收基本养老保险费(含城镇职工基本养老保险、城乡居民基本养老保险、机关事业单位养老保险)、基本医疗保险费(含城镇职工基本医疗保险和城乡居民基本医疗保险。自2017年7月1日起，新型农村合作医疗保险并入城乡居民基本医疗保险)、失业保险、工伤保险、生育保险等社会保险费。

1.6 PVX介导的BYDV GAV蛋白质系统表达

使用引物PVXBYDVP1-F/PVXBYDVP1-R、PVXBYDVP2-F/PVXBYDVP2-R和PVXBYDVCP-F/PVXBYDVCP-R，利用同源重组的方法将BYDV P1、P2和CP构建到pGR106载体上。将构建成功的PVXP1、PVXP2、PVXCP表达载体进行农杆菌转化，对利用菌液PCR验证正确的单菌落进行摇菌。将PVXP1、PVXP2、PVXCP农杆菌分别单独浸润本氏烟，以PVX作为对照，OD600值定为0.5，浸润后黑暗处理12 h。观察植株是否出现危害症状，记录天数并进行叶片拍照，取样放入-80 ℃备用。

1.7 Western Blot检测

接种PVXP1、PVXP2、PVXCP和PVX 5 d后，取植株系统叶。将取样叶片进行蛋白质提取，以PVX载体作为对照，将蛋白质样品进行SDS-PAGE凝胶电泳；利用20 V、20 min条件进行转膜；用5%的脱脂奶粉对PVDF膜进行封闭；一抗是PVX-CP抗体，稀释8 000倍，二抗是过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体，稀释10 000倍；用底物化学发光剂eECL(诺唯赞生物试剂公司)进行显色。

2 结果与分析

2.1 BYDV GAV编码蛋白质P1、P2和CP的遗传进化分析

通过Mega 7.0构建系统进化树，对BYDVGAV株系P1、P2和CP蛋白的核苷酸序列进行同源进化分析，如图1所示，根据P1的核苷酸序列，BYDV GAV的分离物聚到一小支，与BYDV PAV株系分离物在一个大的分支上，与BYDV GPV和RMV株系分离物亲缘关系较远；BYDV PAV中国分离物聚到一个小支，美国和澳大利亚分离物聚在一个小支。根据P2的核苷酸序列构建的系统进化树与P1的较为相似，BYDV GAV与PAV株系分离物亲缘关系近，与BYDV GPV和RMV株系分离物亲缘关系较远(图2)。根据CP的核苷酸序列构建的系统进化树表明，BYDV GPV运城分离物(KP096592.1)与其他BYDVs分离物亲缘关系都较远，单独形成一支，GAV与PAV亲缘关系最近，二者能够与RMV分离物形成一个分支，而与GPV亲缘关系远(图3)。综上表明，BYDVs的4种分离物中，PAV与GAV在核苷酸水平上的亲缘关系最近。

图1 P1编码序列的同源进化分析Fig.1 Homologous evolution analysis of the coding sequence of P1

图2 P2编码序列的同源进化分析Fig.2 Homologous evolution analysis of the coding sequence of P2

图3 CP编码序列的同源进化分析Fig.3 Homologous evolution analysis of the coding sequence of CP

2.2 BYDV GAV编码蛋白质 P1、P2和CP的亚细胞定位

分别构建P1-YFP、P2-YFP和CP-YFP重组表达载体，将含有P1-YFP、P2-YFP和CP-YFP质粒的农杆菌菌液分别浸润本氏烟叶片，接种后2 d通过激光共聚焦显微镜观察YFP荧光，结果表明，P1、P2和CP均定位在核质中(图4)。

图4 P1、P2和CP的亚细胞定位Fig.4 Subcellular localization of P1，P2 and CP

2.3 BYDV GAV编码P1、P2和CP蛋白与其他蛋白质的体内互作验证

分别扩增P1、P2、CP、MP和P6的全长阅读框，构建到双分子荧光互补载体nYFP和cYFP上，通过两两组合共15个组合浸润本氏烟，接种后2 d通过激光共聚焦显微镜观察本氏烟细胞，结果表明，P1-nYFP和P1-cYFP共浸润后可以在细胞四周观察到点状YFP荧光，表明P1能够在体内互作(图5)，其他组合均未观察到荧光(表2)。

图5 P1在体内相互作用的验证Fig.5 Verification of the self-interaction of P1 in vivo

表2 BYDV GAV的P1、P2和CP蛋白与其他蛋白质相互作用观察结果Tab.2 The observation results of the interaction between P1，P2，CP and other proteins encoded by BYDV GAV

2.4 BYDV GAV编码蛋白质P1、P2和CP异源表达对PVX致病性的影响

分别构建P1、P2和CP的PVX重组表达载体，转化农杆菌后浸润本氏烟，接种5 d后异源表达CP的PVX载体处理可以明显地观察到系统花叶症状，而PVX对照和PVXP1、PVXP2处理都尚未产生系统症状，表明CP促进了PVX的症状形成(图6-A)。采用PVX-CP的抗血清通过Western Blot检测PVX的积累量，结果与症状一致，PVXCP处理可以明显观察到PVX的积累，而其他重组载体处理未能检测到病毒的积累(图6-B)。为了确定PVX、PVXP1和PVXP2的侵染性，采集接种后10 d的系统叶进行Western Blot检测，结果表明，接种后10 d，PVX、PVXP1、PVXP2和PVXCP处理都可以检测到CP的积累。

A.接种本氏烟后5 d的植株症状；B.分别在接种后5，10 d检测病毒积累量。A.The symptom of plants at 5 d post infiltration(dpi)；B.Detection of viral accumulation at 5，10 dpi，respectively.

3 结论与讨论

BYDV GAV是我国小麦黄矮病的主要病原[14]，P1、P2和CP是该病毒编码的3个蛋白质，目前这3个蛋白质在BYDV GAV侵染中的作用鲜有报道。本研究通过瞬时表达观察三者的亚细胞定位发现，P1和P2蛋白定位于核质，这与PSORT Ⅱ在线预测(https：//psort.hgc.jp/form2.html)的结果一致；CP-YFP融合蛋白定位于核质，而PSORTⅡ和LOCALIZER(http：//localizer.csiro.au/)在线预测CP定位于线粒体和细胞核。

研究病毒蛋白质间的相互作用发现，P1能够在体内自身互作，而其他蛋白质之间体内互作强度可能较弱，因而没有检测到。本研究中，P1和P2的表达对PVX的侵染没有明显影响，推测P1和P2可能参与了病毒侵染的其他过程。已有研究表明，马铃薯卷叶病毒(Potatoleaf-rollvirus，PLRV)编码的P1和P2参与了病毒的复制[21]，病毒蛋白质之间的互作能够有助于病毒的复制和移动。本研究中，通过体内互作的方式确定了P1的自身互作，表明P1可能通过形成点状聚集体的形式参与复制。

黄症病毒属甜菜西黄病毒(Beetwesternyellowsvirus，BWYV)的CP突变体能够抑制该病毒的系统侵染[22]，本研究发现，BYDV GAV CP蛋白的表达可以显著促进PVX的系统侵染和症状形成，与黄症病毒属BWYV的结果一致。此外，研究发现，抗小麦黄矮病相关蛋白激酶TiDPK1与BYDV PAV和GAV株系的CP蛋白能够互作[23]，表明CP可能参与了相关病毒的致病过程。

BYDV-GAV编码的蛋白质P1、P2和CP均通过定位于核质中发挥作用，P1在体内能够以点状二聚体的状态参与病毒的侵染，CP异源表达能够显著促进PVX的系统性侵染。