舟山海岛地区蜱媒病原体多样性及其基因同源性分析

李科峰 梁思慧 戴亚欣 刘洁楠 仝振东

舟山市疾病预防控制中心传防科，舟山 316021

蜱属体外寄生生物，寄生于两栖类、鸟类、爬行类和哺乳类等动物，部分种类可侵袭人类，传播多种病原体。研究表明，蜱的整个生命周期均可携带病原体[1-2]，其造成的危害仅次于蚊类[3-4]。据报道，全球以发热伴血小板减少综合征为代表的蜱媒传染病(TBD)发病率不断上升[5-6]。舟山市蜱密度高，有学者在岱山采集到的长角血蜱中检测出无形体和一种新的埃立克体病原体[7]。本研究采集舟山各县区环境中的游高蜱或者动物身上的寄生蜱，开展TBD病原体的检测，了解其分布，为舟山市TBD防控提供科学依据，现报告如下。

材料与方法

一、蜱样本的采集与分类

2020年4—11月采集舟山各县区不明原因发热伴血小板减少征病例居住环境中的游离蜱及家畜身上的寄生蜱。选用布旗法，采集野外草地上的游离未吸血蜱；选用畜体检查法，采集家畜身上的寄生蜱，于实验室解剖显微镜下进行分类。

二、试剂与仪器

一步法实时荧光定量RT-PCR试剂盒（RR064A）、一步法RT-PCR试剂盒（RR055A）、PCR试剂盒（RR902A）均购自宝生物工程（大连）有限公司，新布尼亚病毒、腹地病毒、流行性出血热病毒（汉城型）、流行性出血热病毒（汉滩型）、嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量RT-PCR的引物、探针、测序用引物以及阳性重组质粒委托宝生物工程（大连）有限公司合成与构建。嗜吞噬细胞无形体与查菲埃立克体巢式PCR引物委托第三方生物技术公司合成。

主要仪器有Ⅱ级生物安全柜（美国LABCONCO公司）、ViiA7实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）、普通PCR仪（美国ABI公司）、成像仪（美国ABI公司）、LEGEND MICRO冷冻高速离心机（德国Thermo公司）、MM400混合球磨仪（德国Retsch公司）。

三、核酸制备

将采集的蜱样本根据体型大小选取3～6只为1组，放入2 mL EP管中，用25%酒精消毒蜱体表1 min后，去除上清液。加入1 mL 2-甲氧基乙氧基甲基氯（MEM）涡旋清洗，8 000转/min离心（离心半径8.4 cm），5 min去除上清液，反复3次。加入500 μL MEM后，于低温下在MM400混合球磨仪中以50 Hz研磨2 min，反复2次。8 000转/min低温离心5 min后（离心半径8.4 cm），取上清液200 μL提取RNA进行荧光RT-PCR检测。余下300 μL上清液，其中200 μL用于复核，100 μL用于病毒分离。

四、核酸检测

实时荧光定量RT-PCR检测发热伴血小板减少综合征病毒（SFTS）RNA参照《发热伴血小板减少综合征防治指南（2010版）》[8]检测方案，荧光RT-PCR引物探针序列参考中国CDC提供的序列[9]；巢式PCR检测嗜吞噬细胞无形体DNA参照中华人共和国出入境检验检疫行业标准-国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的PCR检测方法（SN/T 4009-2014）；巢式PCR检测查菲埃立克体DNA参照湖北省CDC张令要等[10]报道方法，运用PCR对采集的蜱样本进行嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因片段进行扩增和序列分析。蜱样本中嗜吞噬细胞无形体与立克次体通用引物PCR电泳阳性条带者再用特异引物进行电泳。荧光RT-PCR引物探针和巢式PCR引物详见表1和表2。

表1 五种病原体实时荧光定量RT-PCR检测引物探针序列

表2 嗜吞噬细胞无形体与相关体巢式PCR外套引物序列

结 果

一、蜱样本采集及检测情况

共采集蜱样本99只，其中游离蜱样本39只，寄生蜱样本60只。根据是否游离蜱进行分组，分为20组，每组3～6只蜱虫，1～7组为游离蜱（共7组），8～20组为寄生蜱（共13组）。

本研究未检出查菲埃立克体、新型布尼亚病毒、汉坦与汉城病毒。在7组游离蜱样本和13组寄生蜱样本中，分别有3组和1组检测出嗜吞噬细胞无形体。此外，在游离蜱样本中，分别有2组和1组检测出立克次体和沃尔巴克体；在寄生蜱样本中检测出1组山羊无形体。其余组别的病原体检出均阴性。蜱虫样本PCR检测结果见图1和图2。

图1 舟山海岛地区蜱样本中嗜吞噬细胞无形体与立克次体通用引物PCR电泳图

图2 舟山海岛地区蜱样本中嗜吞噬细胞无形体与立克次体特异引物PCR电泳图

二、序列分析结果

巢式PCR检测阳性结果经16S rRNA[11]基因测序显示，2号组样本为沃尔巴克体，与日本报道的沃尔巴克体（AB025965）同源性为98.70%，与无形体16S rRNA基因序列相似度为88.50%～88.70%。3和6号组样本为立克次体，与中国云南立克次体03（KY433580）、日本立克次体LA16[12]同源性为99.83%，与无形体16S rRNA基因序列相似度达82.60%～83.90%。4、5、7、18号组为嗜吞噬细胞无形体（同源性为97.74%～99.75%），在基因进化中可分为2个分支，5和18号组为一个进化分支与安徽桐城（MK045683）及韩国济州岛（GU064903）的嗜吞噬细胞无形体同源性为100%；4和7号组与安徽金寨的嗜吞噬细胞无形体 （MK045694）同源性为99.70%。详见图3和4。

图3 舟山海岛地区无形体、立克次体与沃尔巴克16SrRNA基因进化树

图4 舟山海岛地区无形体16S rRNA基因进化树

讨 论

自2011年舟山市首次报告发热伴血小板减少综合征病例以来，疫情逐年上升，一度成为浙江省发热伴血小板减少综合征发病率最高的地区[13]。在监测中发现，每年均有部分有蜱叮咬史的病例检测新型布尼亚病毒呈阴性，分析原因可能携带其他病原体。在本次研究中，我们首次在舟山海岛地区蜱发现携带日本立克次体、嗜吞噬细胞无形体、山羊无形体、沃尔巴克体等病原体，提示舟山居民有多种TBD病原体的暴露风险，为当地TBD的防控提供科学依据，为其他地区相关研究提供参考。

无形体感染会引起无形体病，该病是一种以发热伴白细胞血小板减少和多脏器功能损害为主要临床表现的人畜共患自然疫源性疾病[14-15]。立克次体属分斑点热群和斑疹伤寒群，是一类能引起人感染而引发斑点热的细菌，其中日本立克次体可引起日本斑点热。浙江省学者曾在杭州临安区的病例中分离到日本立克次体[12]。本文作者在舟山捕获的游离蜱样本中检测出嗜吞噬细胞无形体、日本立克次体和沃尔巴通体3种病原体，在寄生蜱中检出山羊无形体和嗜吞噬细胞无形体2种病原体，其中立克次体与中国云南立克次体03（KY433580）、日本立克次体LA16[12]同源性为99.83%；检出的嗜吞噬细胞无形体其中一个进化分支与安徽桐城（MK045683）及韩国济州岛（GU064903）的嗜吞噬细胞无形体同源性达100.00%，主要为游离蜱；另外一支与安徽金寨的嗜吞噬细胞无形体（MK045694）同源性为99.70%，包括游离蜱和寄生蜱。以上结果提示舟山市是嗜吞噬细胞无形体、山羊无形体和日本立克次体的自然疫源地，暴露居民存在感染风险。虽然本研究在捕获的蜱虫中未检出新型布尼亚病毒核酸，但舟山市是发热伴血小板减少综合征的疫区，仍需要高度重视。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明李科峰：课题设计、研究、论文撰写；梁思慧、戴亚欣：数据分析、论文修改；刘洁楠、仝振东：蜱虫捕获、检测