LncRNA MEG3对脑胶质瘤细胞替莫唑胺获得性耐药的影响

朱 君，朱正春，秦学金，张 迪，郗玉巧，李 佳，仲 飞,4

脑胶质瘤是源自神经上皮的恶性肿瘤，其恶性程度、致死率、复发率以及对化疗的耐药性均较高[1]。2014年至2018年期间，CBTRUS统计报告有83 029人死于中枢神经系统肿瘤，其中最常见是胶质母细胞瘤[2]。替莫唑胺(temozolomide, TMZ)为基础的系统化疗对脑胶质瘤有确切疗效[3]。但是对于TMZ耐药的脑胶质瘤，很难预防其进展或复发[4]。因此，阐明TMZ耐药的发生机制在临床上对改善胶质瘤的化疗效果有极其重要的意义。LncRNA被归类为具有调控作用的非编码RNA[5]。有研究[6]证明LncRNA在癌症的起始、进展和化疗耐药过程中起到重要作用。LncRNA MEG3是LncRNAs中的一种，参与多种肿瘤耐药性的调控[7]，但是其是否参与调控胶质瘤的耐药性鲜有报道，现以U87/TMZ细胞为研究对象，观察LncRNA MEG3对其耐药性的影响，以期为临床逆转胶质瘤耐药研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞株 人脑胶质瘤细胞株U87购自上海科学院细胞库。

1.1.2主要试剂 替莫唑胺(货号：T2577-25MG)购自美国Sigma公司；U-87 MG细胞专用培养基(货号：CM-0238)购自武汉普诺赛生命科技有限公司，胰酶消化液(货号：SH30042.01B)购自美国Hyclone公司；胎牛血清(货号：11011-8611)购自浙江天杭生物科技股份有限公司；RNA提取试剂盒(货号：15596018)、qRT-PCR试剂盒(货号：CS11733046)、脂质体Lipofectamine 2000(货号：11668)购自美国 Invitrogen公司；RIPA裂解液(货号：P0013C)、BCA蛋白定量试剂盒(货号：P0012)、ECL液(货号：P0018AS)、MTT检测试剂盒(货号：C0009S)及细胞凋亡检测试剂盒(货号：C1062M)购自碧云天生物技术有限公司；Matrigel基质胶(货号：356234)购自美国 BD公司；Transwell小室(货号：3421)购自Corning公司；抗体购自Abcam公司，一抗：MDM2抗体(货号：ab259265)、 p53抗体(货号：ab32389)、GADPH抗体(货号：ab263962)；二抗：辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG(货号：ab97126)、羊抗兔 IgG(货号：ab97051)，所有引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.3主要仪器 QP-80二氧化碳培养箱(中国济南鑫贝西生物技术有限公司)；TS100型倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；CFX ConnectTM实时荧光定量 PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪(美国Bio-Rad公司)；全自动酶标仪(美国Molecular Devices 公司)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter FC500公司)。

1.2 方法

1.2.1胶质瘤细胞株U87的培养 用U-87 MG细胞专用培养基(MEM+10% FBS+1% P/S Solution)培养细胞，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2获得性TMZ耐药胶质瘤细胞的构建 将U87细胞(1×105/ml)暴露于初始浓度为5 μg/ml的TMZ中15～20 d。观察细胞生长情况，U87细胞生长至对数期后，倍增TMZ浓度继续诱导，直至TMZ浓度达160 μg/ml，每个梯度浓度(5、10、20、40、80、160 μg/ml)培养15～20 d。最终获得耐药细胞U87/TMZ。

1.2.3细胞转染 将U87/TMZ细胞以5×105个/孔接种至6孔板，融合度达70%～80%时，用脂质体 Lipofectamine 2000转染pcDNA-MEG3至U87/TMZ中作为LncRNA MEG3过表达组，转染pcDNA至U87/TMZ中作为LncRNA MEG3空载体组，以常规培养的U87/TMZ作为空白组。设置组别如下：pcDNA-MEG3组、pcDNA组、Control组。转染48 h后观察，然后用10 μg/ml TMZ继续处理细胞用于后续实验。

1.2.4qRT-PCR检测细胞中LncRNA MEG3的表达 取对数生长期的U87和U87/TMZ细胞，根据试剂盒操作步骤，采用TRIzol法提取细胞总RNA，然后逆转录成cDNA。后续cDNA被用作检测基因表达的模板进行PCR扩增反应。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt计算LncRNA MEG3的表达。LncRNA MEG3引物序列F：5′- GGGCATTAAGCCCTGACCTT-3′，R：5′-CCTTGGGGAGGGAAACACTC-3′；内参GADPH引物序列F：5′-ATGTTGCAACCGGGAAGGAA -3′，R：5′-AGGAAAAGCATCACCCGGAG -3′。

1.2.5Western blot 检测U87/TMZ细胞中LncRNA MEG3相关蛋白表达变化 pcDNA-MEG3组、pcDNA组、Control组细胞转染成功后，再用10 μg/ml TMZ处理48 h，用RIPA裂解细胞，从三组细胞中提取蛋白质，并用BCA法进行蛋白定量。进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上，并用封闭液室温封闭2～3 h，一抗孵育12 h，一抗浓度为：MDM2 (1 ∶400)、p53(1 ∶400)、GAPDH(1 ∶1 000)，二抗孵育2 h，二抗浓度为：抗羊(1 ∶5 000)、抗兔(1 ∶3 000)。ECL发光检测，以GAPDH作为内参，分析结果。

1.2.6MTT法检测细胞增殖 将所需细胞培养至对数期，以9×103个/孔传代至96孔板中。次日，加入含梯度浓度(5、10、20、40、80 μg/ml)TMZ处理48 h。处理结束后加入MTT溶液20 μl，4 h后加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，用酶标仪检测490 nm下的吸光度。

1.2.7细胞克隆实验检测细胞增殖情况 收集pcDNA-MEG3组、pcDNA组、Control组细胞，调整细胞密度，接种至6孔板中，在含10 μg/ml TMZ的培养基中培养。2～3周后用4%多聚甲醇固定细胞，GIMSA染色10～30 min，洗去染液后拍照进行图像分析。

1.2.8Transwell实验检测细胞侵袭 将基质胶与无血清培养基以1 ∶3的比例配置，每个Transwell小室中加入50 μl，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中凝固。收集pcDNA-MEG3组、pcDNA组、Control组细胞，用含有10 μg/ml TMZ无血清培养基培养细胞,调整细胞浓度为1×105/ml，在上室加入100 μl细胞悬液，24孔板底部中加入600 μl含10%血清培养液，常规培养48 h，再用甲醇固定30 min，适当风干后，结晶染液染色15 min，在显微镜下计数。

1.2.9流式细胞技术检测细胞凋亡 收集pcDNA-MEG3组、pcDNA组、Control组细胞，调整细胞密度，用10 μg/ml TMZ处理细胞，然后分装到5 ml离心管中，1 000 r/min离心5 min。按照试剂盒说明书用PBS洗涤2次后加入binding buffer(500 μl)，加入 Annxine-FITC(5 μl)和 Propidiumlodide(5 μl)混匀，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.10动物实验 4周龄BALB/c雌性裸鼠12只，购自上海灵畅生物科技有限公司，饲养于SPF级动物房，温度(23±2) ℃，湿度50%～56%。该实验相关内容经安徽医科大学实验动物伦理委员会批准。收集2×106个U87/TMZ细胞(pcDNA-MEG3组和pcDNA组细胞)，接种于裸鼠右侧腋窝。在注射U87/TMZ细胞25 d后，每天向小鼠体内注射5 mg/kg TMZ。实验结束后，吸入麻醉处死小鼠，记录肿瘤体积和重量。

2 结果

2.1 U87细胞和U87/TMZ细胞的增殖能力MTT实验结果显示，U87细胞与U87/TMZ细胞用5、10、20、40、80 μg/ml TMZ处理48 h后，细胞抑制率逐渐升高。与U87细胞相比，U87/TMZ细胞的抑制率下降(P<0.01)，见图1。

图1 不同浓度TMZ对U87和U87/TMZ细胞生长抑制率的影响与U87细胞比较：**P<0.01

2.2 LncRNA MEG3在U87细胞和U87/TMZ细胞中的表达qRT-PCR结果显示，在mRNA水平上，U87/TMZ细胞中LncRNA MEG3的表达量低于U87细胞(t=61.85,P<0.01)，见图2。

图2 U87和U87/TMZ细胞 LncRNA MEG3表达情况与U87细胞比较：**P<0.01

2.3 U87/TMZ细胞中LncRNA MEG3基因表达变化qRT-PCR检测结果显示，与pcDNA组和Control组比较，pcDNA-MEG3组LncRNA MEG3 mRNA的表达水平较高(F=602.4,P<0.01)，见图3。

图3 转染后各组U87/TMZ细胞LncRNAMEG3的表达情况与Control组比较：**P<0.01；与pcDNA组比较：##P<0.01

2.4 U87/TMZ细胞LncRNA MEG3相关蛋白表达变化Western blot结果显示，与Control组和pcDNA组相比，pcDNA-MEG3组的MDM2蛋白表达降低(F=28.1,P<0.01)，p53蛋白表达升高(F=22.14,P<0.01)，见图4。

图4 转染后各组U87/TMZ细胞MDM2、p53蛋白的表达情况与Control组比较：**P<0.01；与pcDNA组比较：##P<0.01

2.5 LncRNA MEG3过表达联合TMZ(10 μg/ml)对U87/TMZ细胞增殖的影响细胞克隆实验结果显示，与Control组和 pcDNA组比较，pcDNA-MEG3组的细胞增殖速度降低(F=389,P<0.01)，见图5。

2.6 LncRNA MEG3过表达联合TMZ(10 μg/ml)对U87/TMZ细胞侵袭的影响Transwell实验结果显示，与Control组和 pcDNA组比较，pcDNA-MEG3组的细胞侵袭能力降低(F=594.4,P<0.01)，见图6。

图6 转染后各组U87/TMZ细胞侵袭能力的影响情况 ×40与Control组比较：**P<0.01；与pcDNA组比较：##P<0.01

2.7 LncRNA MEG3过表达联合TMZ(10 μg/ml)对U87/TMZ细胞凋亡率的影响流式细胞术检测结果显示，与Control组和 pcDNA组比较，pcDNA-MEG3组的细胞凋亡率升高(F=477.6,P<0.01)，见图7。

图7 转染后各组U87/TMZ细胞凋亡的影响情况与Control组比较：**P<0.01；与pcDNA组比较：##P<0.01

2.8 LncRNA MEG3过表达联合TMZ对小鼠移植瘤生长的影响与pcDNA组相比，pcDNA-MEG3组的肿瘤生长减弱。肿瘤切除后，pcDNA-MEG3组肿瘤体积小于pcDNA组(P<0.01)，pcDNA-MEG3组肿瘤质量小于pcDNA组(t=12.02,P<0.01)，见图8。综上所述， LncRNA MEG3的过表达在体外和体内都逆转了TMZ耐药胶质瘤细胞的化疗耐药性。

图8 小鼠体内成瘤情况A：右侧腋下原位移植瘤图；B：裸鼠肿瘤形态和大小；C：移植瘤的体积生长曲线；D：两组移植瘤的质量；与pcDNA组比较：**P<0.01

3 讨论

化疗是癌症治疗中的主要治疗手段之一，90%的化疗失败都与肿瘤耐药相关[8]。肿瘤细胞可由于内在因素(如突变、易位、表观遗传因素)和外在因素(如缺氧、pH、激素、抗肿瘤药物)而产生耐药性[9]。笔者推测LncRNA MEG3可能参与TMZ在胶质瘤中的耐药性调控。本研究通过MTT法检测胶质瘤细胞和TMZ耐药胶质瘤细胞的细胞活力，采用qRT-PCR法检测LncRNA MEG3在胶质瘤细胞和TMZ耐药胶质瘤细胞表达量，发现TMZ耐药胶质瘤细胞的细胞活力和 LncRNA MEG3表达水平更低。构建LncRNA MEG3过表达的TMZ耐药胶质瘤细胞，并设置空载体和对照组；Western blot法分析各组细胞LncRNA MEG3相关蛋白表达；细胞克隆实验、Transwell实验、流式细胞术检测各组细胞增殖、侵袭、凋亡能力，发现LncRNA MEG3过表达组的 LncRNA MEG3 mRNA及p53蛋白表达水平均有上调，MDM2蛋白表达下调，过表达的LncRNA MEG3能抑制细胞的增殖、侵袭和凋亡能力。小鼠实验进一步表明，LncRNA MEG3的过表达逆转了TMZ耐药的胶质瘤细胞的化疗耐药性。

已有文献[10-14]报道LncRNA MEG3 在肿瘤抑制中发挥重要作用，并参与了多种肿瘤的耐药性调控，包括结直肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌等。本研究表明LncRNA MEG3在TMZ耐药胶质瘤细胞中表达降低，其过表达可逆转对TMZ的耐药性。因此，LncRNA MEG3可能成为TMZ耐药胶质瘤化疗的一个预后分子标志物和潜在靶点。有文献[15]报道胶质瘤化疗耐药可能与细胞铁死亡、凋亡、焦亡等死亡机制相关。然而，LncRNA MEG3在胶质瘤耐药中的确切生物学行为及其具体分子机制还需进一步研究，为今后胶质瘤的临床基因治疗和新型抗肿瘤药物的研发提供新的思路和理论依据。