六味五灵片对硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化的保护作用

代炆璋，林 丽，陈媛媛，丁凯欣，石 伟，柏兆方，肖小河*

（1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2.中国人民解放军总医院第五医学中心肝病医学部，北京 100039）

肝纤维化一个严重的公共卫生问题，一般是指肝脏受到各种慢性炎症损伤时出现肝内结缔组织异常增生，导致细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积的一种代偿性病理过程，如不及时干预，会逐步发展成为肝硬化甚至肝癌[1-2]。 因此，治疗肝纤维化对预防肝硬化及肝癌具有重要意义。 然而，目前市面尚无有效治疗肝纤维化的药物[3-4]。

中药复方制剂具有多成分、多靶点、多环节的作用特点，近年来在抗肝纤维化方面发挥了综合治疗的特色和优势，如扶正化瘀胶囊、鳖甲软肝胶囊、六味五灵片等，具有疗效高、副作用小、费用低等优点[5-7]。 六味五灵片由五味子、女贞子、连翘、莪术、苣荬菜、灵芝孢子粉等中药组成，有研究证实，六味五灵片在临床上具有良好的抗肝纤维化效果[8]。 本课题组前期研究也发现，六味五灵片可以通过阻止核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）p65 的活化和核因子κB 抑制蛋白（inhibitor κB binding protein, IκB）α的磷酸化发挥对胆管结扎（bile duct ligation, BDL）和四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）诱导的肝纤维化动物模型的保护作用[9-11]。 有进一步药理研究表明，该方中木脂素类成分可以抑制肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）-T6 细胞增殖，单体成分五味子乙素（Sin B）已被证明可以通过抑制TGF-β/Smad 信号通路阻断HSC 的激活，减轻大鼠肝纤维化的进展[12-15]。由于肝纤维化、肝硬化的病理生理机制复杂，不同的动物实验模型并不能体现全部的肝纤维化成因，为了更全面地反映人类肝纤维化的病程发展特点，本研究拟通过硫代乙酰胺（thioacetamide, TAA）诱导建立大鼠肝纤维化模型，探讨六味五灵片对TAA 诱导的大鼠肝纤维化的保护作用，为六味五灵片抗肝纤维化的开发利用提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，体质量(200±20) g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司（合格证号：NO.110324200101925524）；饲养于解放军总医院第五医学中心动物实验中心，自由进食及饮水，每天12 h光照/黑暗处理，温度20～25 ℃，相对湿度为55%～65%。 相关动物实验通过中国人民解放军第五医学中心动物伦理委员会审查（伦理编号：IACUC-2020-0033），动物饲养与管理均符合《中华人民共和国实验动物管理条例》要求。

1.2 实验药物与试剂

六味五灵片及空白片(辅料片)，由山东世博金都药业有限公司提供（批号：200301）；扶正化瘀胶囊（批号：191003）由上海黄海制药有限公司提供；硫代乙酰胺（批号：200326335X）购自南京化学试剂有限公司；羧甲基纤维素钠（批号：20200410，化学纯）、乌来糖（批号：20190419，化学纯）均购自国药集团化学试剂有限公司；氯化钠注射液（批号：2007173204）由石家庄四药有限公司生产；谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotrans ferase, AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要仪器

超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司，型号：DW-86L728J）；震板仪（海门其林贝尔公司，型号：QB-9002）；酶标仪（美国伯腾仪器公司，型号：BioTek Epoch）；研磨仪（上海静信实业发展有限公司，型号：Tissuelyser-24）；高速低温离心机（美国Sigma 公司，型号：3-18K）；荧光定量PCR 仪（美国赛默飞公司，型号：Quantstudio 6 Flex）；手掌离心机（杭州奥盛公司，型号：MINI6K）；震荡器（美国Scientific Industries公司，型号：Vortex-Genie 2）。

1.4 动物造模及给药

将70 只SD 大鼠适应性喂养一周后随机分为7组，设置正常对照组（N 组）、模型组（M 组）、阳性对照药扶正化瘀胶囊组（Y 组）、六味五灵片低剂量组（LL 组，202.5 mg·kg-1）、六味五灵片中剂量组（LM组，405 mg·kg-1）、六味五灵片高剂量组（LH 组，810 mg·kg-1）和辅料组（F 组），每组10 只，以1 mL/100 g 给药，剂量设置参照文献和临床给药剂量[7-8]。用TAA 诱导化学性损伤肝纤维化模型，除N 组外，其余各组采用腹腔注射3%硫代乙酰胺（TAA,150 mg·kg-1）溶液，每周3 次连续2 周，第3 周后每周2 次，直至实验结束。 N 组注射等体积的相同溶剂；第3 周开始，Y 组、LL 组、LM 组、LH 组、F 组每天灌胃相应剂量的药物，治疗药物混悬于0.5%的羧甲基纤维素钠溶液中；N 组和M 组则灌胃等体积的0.5%羧甲基纤维素钠，共给药6 周。

1.5 动物一般情况观察

对实验大鼠的外观体征、行为活动、体质量变化进行观察记录。

1.6 样本收集

第6 周给药结束时，禁食不禁水12 h，称重后腹腔注射乌来糖（30%，0.7 mg·kg-1）对大鼠进行麻醉，下腔静脉取血，1300 g 离心10 min，收集血清用于后续指标检测；取肝组织，称重，将肝大小叶分离，大叶固定在10%中性福尔马林固定液中用于HE、Sirius red、Masson 染色，小叶保存在-80 ℃冰箱用于后续实验。

1.7 血清生化指标检测

采用酶标仪法检测血清中ALT、AST、ALP 水平；ELISA 法测定血清中LN 的水平。

1.8 肝脏组织中mRNA 的表达水平检测

取出保存于-80 ℃冰箱中的肝组织，称取30 mg肝组织于EP 管中，按说明加入1 mL Trizol 试剂于匀浆仪中提取总RNA 后将其逆转录为cDNA。取cDNA模板0.3 μL， 加入Mix 5 μL，DEPC 处理水4.2 μL，正反引物各0.25 μL，共10 μL 体系。置于荧光PCR 仪上进行分析，反应条件为95 ℃3 min、95 ℃3 s、60 ℃30 s、95 ℃15 s、60 ℃1 min、95 ℃15 s。 得到各样本Ct 值，并以GAPDH 为内参，运用公式2-△△Ct计算靶基因的的相对表达量。 引物序列见表1。

表1 目的基因引物序列

1.9 统计学分析

采用GraphPad Prism 6.0 软件进行统计学分析，所有实验数据以“±s”表示；采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多组间比较。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般状况观察

N 组大鼠状态良好，行动自如，皮毛光泽较好，饮食和排便正常，体质量明显增加。 M 组大鼠精神明显萎靡，摄食减少，活动迟缓，皮毛欠光泽；与M组比较，LL 组、LM 组、LH 组及Y 组摄食量增加，精神萎靡和活动迟缓状况改善明显。

2.2 大鼠血清中ALT、AST、ALP 水平的变化

与N 组相比，M 组大鼠血清中ALT、AST、ALP水平显著升高（P＜0.001）；与M 组相比，Y 组、LL 组、LM 组、LH 组血清ALT、AST、ALP 水平均明显下降（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），且具有一定的剂量依赖性，但F组ALT、AST、ALP 水平同M 组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见表2。

表2 六味五灵片对TAA 诱导的化学性肝纤维化大鼠血清中ALT、AST、ALP 的影响(U·L-1)

2.3 大鼠血清中LN 水平的变化

与N 组相比，M 组大鼠血清中LN 的含量明显上升（P＜0.001），说明TAA 诱导的大鼠化学性肝纤维化实验造模成功；与M 组相比，Y 组及LL 组、LM组、LH 组大鼠血清中LN 的含量显著降低（P＜0.01或P＜0.001），F 组大鼠血清中LN 的水平同M 组相比，无统计学意义（P＞0.05）。 详见表3。

表3 六味五灵片对TAA 诱导的化学性肝纤维化大鼠血清中LN 的影响

2.4 肝纤维化大鼠肝脏形态及病理变化

与N 组相比，M 组和F 组大鼠的肝组织粘连严重，颜色暗沉无光泽，质地明显变硬，表面粗糙，呈现明显的弥散性粗颗粒状，边缘钝化。 LL 组、LM 组、LH 组和Y 组大鼠肝脏各叶逐渐分离，粘连减轻，质地变柔软并具有一定的光泽。 HE 染色的结果显示，与N 组相比，M 组和F 组大鼠肝组织结构异常，肝索排列紊乱，肝细胞核形态改变，炎性细胞及坏死细胞增多；与M 组相比，LL 组、LM 组、LH 组及Y 组大鼠肝脏内肝细胞坏死和炎性细胞浸润均有明显改善，且呈现一定的量效关系。 Masson 和Sirius red染色结果显示，与N 组相比，M 组和F 组大鼠肝组织可见较多纤维结缔组织增生，自汇管区周围向外延伸，有明显的假小叶形成；与M 组相比，Y 组、LL 组、LM 组、LH 组肝组织胶原纤维组织增生及纤维化程度均有一定程度的改善，LM 组、LH 组改善尤为明显，虽然也存在一定的胶原纤维组织增生，但无胶原纤维间隔包绕，程度较模型组明显减轻，F 组较M组没有明显变化，Sirius red 定量分析结果与上述一致（P＜0.001）。 详见图1、表4。

表4 六味五灵片对TAA 诱导的化学性肝纤维化大鼠肝组织Sirius red 定量分析结果

2.5 对大鼠肝组织中α-SMA mRNA 表达的影响

与N 组相比，M 组大鼠的肝组织中α-SMA mRNA 的表达水平明显升高（P＜0.001）。 与M 组相比，LL 组、LM 组、LH 组及Y 组均明显抑制肝组织中α-SMA mRNA 的表达（P＜0.01），但F 组α-SMA mRNA 的水平同M 组相比，无统计学意义（P＞0.05）。详见表5。

表5 六味五灵片对TAA 诱导的化学性肝纤维化大鼠肝组织中α-SMA mRNA 的影响

图1 六味五灵片对TAA 诱导的化学性肝纤维化大鼠肝组织病理学变化的影响

3 讨论

肝纤维化本质是机体对肝实质损伤的一种修复反应，在肝细胞被各种炎性因子侵袭后，由肝细胞、免疫细胞以及血小板分泌的诸如TGF-β1 等细胞因子刺激HSC 持续增殖和趋化，进而转变为成纤维细胞，导致大量的ECM 沉积，诱发肝纤维化[16-18]。 由于肝纤维化发病机制复杂，单一环节或单一靶点的干预及治疗很难取得理想的疗效，所以临床上仍缺乏特异有效的药物用于治疗肝纤维化。 六味五灵片在临床上是保肝降酶的常用中药复方制剂，具有多成分、多环节、多靶点的作用特点，因此，针对病理机制复杂的肝纤维化有着独特的优势。 TAA 是一种肝毒素，有证据表明，单剂量给予TAA 可导致肝脏炎症反应和肝纤维化的发生，可造成明确的肝损伤[19]。TAA 作为最普遍的肝毒性药物之一，已被广泛应用于肝纤维化动物模型的诱导[20-21]。 与其他实验模型相比，TAA 诱导的肝纤维化会产生与人类相似的难以逆转的纤维化，是测试潜在抗纤维化药物的理想模型[19]。课题组前期在BDL 和CCl4诱导的肝纤维化动物模型上发现了六味五灵片逆转肝纤维化的作用，但肝纤维化的发病机制复杂，为了更全面地反映人类肝纤维化的病程发展特点，进一步证实六味五灵片抗肝纤维化的作用，本实验选择了TAA 诱导的肝纤维化大鼠模型作为实验对象，对六味五灵片抗肝纤维化的作用进行了研究。

肝纤维化继发于肝损伤，因此当肝纤维化发生时，会导致血清中ALT、AST、ALP 等评价肝损伤程度的生化指标升高[22-26]。 在本研究中，造模8 周后，模型组大鼠肝脏均出现了损伤和纤维化，血清ALT、AST、ALP 水平显著升高。经不同剂量的六味五灵片和扶正化瘀胶囊治疗后，以上血清生化指标及肝组织病理损伤状况均得到不同程度的改善，且呈现出一定程度的剂量依赖性。 LN 作为一种膜糖蛋白，是基底膜的主要构成成分，实验研究发现，它与肝纤维化的形成有重要关系，是肝纤维形成的主要基质[27-28]。在正常情况下，肝组织中LN 的含量很低，主要分布在肝胆管和血液中[27]。 但当肝纤维化病情不断发展时，机体血清中的LN 含量随着合成量的增加而不断增强，并大量沉积在肝窦血管壁上，使肝窦腔变窄，肝窦毛细血管化，进一步导致肝纤维化发生。 因此，LN 可以作为早期肝纤维化的诊断指标[28]。 本实验中模型组LN 含量显著增加，说明肝组织纤维化程度加重，六味五灵片和扶正化瘀胶囊可以降低肝组织中LN 含量，并且具有一定的剂量依赖性，效果明显，表明六味五灵片可以改善TAA 诱导的大鼠肝纤维化。作为HSC 激活的主要标记物，α-SMA 蛋白在HSC的持续激活状态下表达增加，促使大量以胶原蛋白Ⅰ为主要成分的ECM 产生和沉积，导致肝纤维化的发生[29-32]。本实验中六味五灵片和扶正化瘀胶囊可以降低TAA 导致的肝组织中α-SMA mRNA 表达水平的增加，提示六味五灵片可能通过抑制HSC 的激活，改善TAA 诱导的大鼠肝纤维化。

综上所述，本实验研究证明了六味五灵片可能通过抑制HSC 的激活发挥对TAA 诱导的大鼠肝纤维化的保护作用，为六味五灵片增加新适应症以及中药制剂抗肝纤维化的开发提供了一定的理论依据。