芪连结肠宁对溃疡性结肠炎模型大鼠TLR4/NF-κB信号通路及肠道菌群的影响

胡锦洋，蒋士生*，牛俊杰*

（湖南省中西医结合医院，湖南 长沙 410006）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是一种机制不明的炎性肠病，极易复发，常迁延难愈[1]。 近年来病理生理学概念认识到肠道菌群在UC 发生发展进程中扮演重要角色，对UC 患者粪便进行菌群检测证实存在明显肠道菌群失调，其生物多样性及丰度减少，肠道菌群失调与肠道炎症相关疾病密切相关[2]。 肠道菌群可通过Toll 样受体的介导过程上调抗炎细胞因子和减少促炎细胞因子，进而调控肠道黏膜免疫系统[3]；同时，正常的肠道菌群可与肠黏膜结合形成生物屏障，拮抗病原微生物及肠毒素的入侵。 芪连结肠宁有益气健脾、清热祛湿的功效，由全国名老中医药专家蒋士生教授所创，对于UC 的治疗收效甚好。本研究旨在通过检测UC 模型大鼠血清及结肠组织中Toll 样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）、核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）p65、白介素-6（interleukin-6, IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的表达和粪便中肠道菌群多样性及优势物种丰度，探讨芪连结肠宁治疗UC 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠40 只，体质量160～200 g，购自湖南斯莱克景达实验动物中心，许可证号：SYXK（湘）2021-0008。 饲养条件：昼夜各12 h 明暗交替，室温22～28 ℃，相对湿度60%，噪声≤80 dB。实验动物饲养于湖南中医药大学动物实验中心，并完成相关伦理审查，动物实验伦理审查号：2021-0088。

1.2 主要药物、试剂及仪器

芪连结肠宁组成：黄芪15 g、人参15 g、炒白术15 g、茯苓15 g，陈皮10 g、黄连10 g、干姜6 g、蒲黄10 g、蒲公英15 g、败酱草15 g、椿皮10 g、木香10 g、白芍15 g、甘草5 g，药物浸泡于蒸馏水中40 min，第一煎大火煮沸后，小火煎煮30 min；第二煎大火煮沸后，小火煎煮20 min，最后将2 次煎煮汤药混合浓缩制成含生药2.48 g/mL 的药液。 所有中药材均购于湖南省中西医结合医院中药房，4 ℃冰箱中保存，使用前预热。

TRIzol 试剂（美国Thermo 公司，批号：10296010）；兔IgG-免疫组织化学试剂盒、HRP-羊抗兔IgG、抗GAPDH 抗体均购自武汉博士德公司（批号分别为15H-1L16F0334、BST15H06A15H65、BST14H06A18G11）；抗NF-κB p65 抗体、抗TLR4 抗体均购自英国Abcam公司（批号分别为ab22048、ab32536）；NF-κB p65、TLR4、IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒均购自美国Proteintech 公司（批号分别为55030、55131、53027、55011）；伊红染液、苏木素染液均购自武汉赛维尔生物科技有限公司（批号分别为ZH201285、ZH209148）。

超微分光光度仪（美国Thermo 公司，型号：Nanodrop200）；实时荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad公司，型号：CFX96）；石蜡切片机（德国徕卡公司，型号：RM2235）；BX43 光学显微镜（日本Olympus 公司，型号：IX73-U）；多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司，型号：SpectraMax5）；高速冷冻离心机（日本日立公司，型号：CR22G Ⅱ）。

1.3 动物分组与造模

采用随机数字表法将40 只SD 大鼠随机分为正常组、模型组、芪连结肠宁低剂量组、芪连结肠宁中剂量组及芪连结肠宁高剂量组，每组8 只。 参照文献[4]，模型组和芪连结肠宁各剂量组大鼠均采用5%葡聚糖硫酸钠 （dextran sulfate sodium, DSS）喂养，即用蒸馏水配制浓度为5%的DSS 溶液，然后放入饮水瓶中自由饮用7 d 以建立UC 大鼠模型。 正常组大鼠常规饲养。 造模第7 天随机选取2 只大鼠处死，以疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分升高及结肠黏膜出现损伤表示造模成功[5]。 体质量降低率、大便性状、便血情况根据各自严重程度，均计0～4 分，评分越高，程度越严重。DAI=（体质量下降率分数+大便性状分数+便血情况分数）/3。

1.4 干预方法及DAI 测定

造模结束后第2 天起开始灌胃给药。 根据人临床用量的等效剂量和动物体表面积计算[6]，芪连结肠宁低、中、高剂量组每次分别给予含生药为1.24、2.48、4.96 g/kg 的浓度灌胃，空白组、模型组均以2 mL生理盐水灌胃，以上各组灌胃均为2 次/d，连续3周。分别于给药前及给药后观察大鼠体质量变化，进食、活动及粪便情况，根据体质量下降、粪便性状和隐血情况，计算DAI。

1.5 HE 染色观察结肠组织形态

末次灌胃结束后，各组大鼠注射戊巴比妥钠（0.5 mg/kg）麻醉后断颈法处死，以生理盐水行心脏灌注，快速取结肠组织（8～10 cm），生理盐水洗净，滤纸吸干水分，一部分放入4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片，苏木素、伊红染色，镜下观察结肠组织形态。另一部分结肠组织液氮速冻，然后于-80 ℃冰箱中保存用于后续检测。

1.6 免疫组织化学法观察结肠组织NF-κB p65、TLR4 蛋白表达情况

取部分结肠组织石蜡切片脱蜡水化。3%过氧化氢溶液封闭10 min，消除内源性过氧化物酶，微波抗原修复后，5% BSA 封闭30 min。 一抗4 ℃（1∶200）孵育过夜，二抗室温（1∶200）孵育30 min，DBA显色。光学显微镜下观察。结果通过Image-Pro Plus 6.0 对NF-κB、TLR4 的平均光密度（optical density,OD）值进行半定量分析。

1.7 ELISA 法测定血清中TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α 蛋白含量

行心脏灌注前，腹主动脉取血，4 ℃静置4 h，4 ℃、3500 r/min，离心半径13.5 cm，离心10 min，取上清液。 严格按照ELISA 试剂盒说明书中的步骤进行标准品制备、加样、孵育等操作，加入终止液后用酶标仪在450 nm 波长处检测每孔OD 值。 通过标准曲线计算每个样品蛋白水平。

1.8 实时荧光定量PCR 检测结肠组织TLR4、NFκB p65、IL-6、TNF-α mRNA 的表达

采用TRIzol 试剂提取结肠组织细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA 的质量和浓度。参照逆转录试剂盒说明，进行逆转录，然后进行PCR 扩增。反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；40 个循环，溶解曲线60～95 ℃测溶解曲线，得出内参及各指标Ct 值。引物由南京诺唯赞生物科技有限公司合成，引物序列详见表1。根据相对定量法2-ΔΔCt计算出mRNA 的相对表达量。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.9 16S rRNA 检测大鼠粪便中肠道菌群的多样性及分布情况

末次灌胃给药结束后无菌采集各组大鼠的直肠段内容物于冻存管中，立即存放至液氮中，2 h 后取出干冰运送至上海美吉生物医药公司，进行16S rRNA 基因测序检测。 根据序列间的相似性（通常为97%）将序列进行聚类，分成多个操作分类单元（operational taxonomic unit, OTU），随后进行物种注释以简化工作量，提高分析的准确率与效率。 Alpha 多样性分析反映的是肠道微生物群落丰度和多样性，主要有Sobs、Chao、Ace、Shannon 及Simpson 5 种衡量指数。 Sobs、Chao 和Ace 是生态学中评估群落丰度的指数，Shannon 和Simpson 是用来估算群落多样性的指数[7]。

1.10 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行分析。 数据均满足正态分布，计量资料以“±s”表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，采用LSD 法；方差不齐，采用Dunnett’s T3 作组间多重比较。 以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠DAI 评分情况

与正常组比较，模型组给药前后DAI 评分均明显升高（P＜0.01）。与给药前比较，芪连结肠宁各剂量组DAI 评分均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。 给药后，芪连结肠宁各剂量组DAI 评分均明显低于模型组（P＜0.05，P＜0.01），芪连结肠宁低剂量组DAI 评分明显高于芪连结肠宁中剂量组（P＜0.05）；芪连结肠宁高剂量组与芪连结肠宁低剂量组DAI 评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；芪连结肠宁高剂量组与芪连结肠宁中剂量组间DAI 评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见表2。

表2 各组大鼠DAI 评分比较（±s，分，n=8）

表2 各组大鼠DAI 评分比较（±s，分，n=8）

注：与正常组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与芪连结肠宁中剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别正常组模型组芪连结肠宁低剂量组芪连结肠宁中剂量组芪连结肠宁高剂量组给药前0.11±0.16 3.18±0.40▲▲3.21±0.67 3.09±0.59 3.16±0.53给药后0.09±0.12 2.95±0.23▲▲2.06±0.30*#△1.17±0.27**##1.66±0.25**##

2.2 各组大鼠结肠组织病理改变情况

正常组小鼠结肠组织结构正常，腺体排列整齐，黏膜上皮组织完整，黏液层正常；模型组小鼠结肠组织结构异常，黏膜表面出现缺损，黏液层部分丢失，大量炎细胞聚集、浸润，腺体破坏甚至丢失。 芪连结肠宁各剂量组结肠组织病理改变不同程度恢复，黏膜腺体排列较整齐，肠壁基本恢复，炎性细胞浸润减轻。 详见图1。

图1 各组大鼠结肠组织HE 染色结果

2.3 各组大鼠结肠组织中NF-κB p65、TLR4 蛋白表达情况比较

与正常组比较，模型组NF-κB p65、TLR4 蛋白表达均明显增加（P＜0.01）。与模型组比较，芪连结肠宁各剂量组NF-κB p65、TLR4 蛋白表达均明显减少（P＜0.05，P＜0.01）。 与芪连结肠宁中剂量组比较，芪连结肠宁高剂量组TLR4 蛋白和芪连结肠宁低剂量组NF-κB、TLR4 蛋白表达均明显增加（P＜0.05）。芪连结肠宁低剂量组与芪连结肠宁高剂量组间NFκB p65、TLR4 蛋白表达比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。 详见图2。

2.4 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量比较

与正常组比较，模型组TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量均明显增加（P＜0.01）。 与模型组比较，芪连结肠宁各剂量组TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与芪连结肠宁中剂量组比较，芪连结肠宁低剂量组、芪连结肠宁高剂量组TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量均明显增加（P＜0.05，P＜0.01）。 芪连结肠宁低剂量组与芪连结肠宁高剂量组间TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。 详见表3。

图2 各组大鼠结肠组织NF-κB p65、TLR4 蛋白表达情况（免疫组织化学法，n=8）

2.5 各组大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表达情况

与正常组比较，模型组TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表达均明显增加（P＜0.01）。 与模型组比较，芪连结肠宁低剂量组IL-6 mRNA 和芪连结肠宁中剂量组、 芪连结肠宁高剂量组TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表达均明显降低（P＜0.05，P＜0.01），芪连结肠宁低剂量组TNF-α mRNA 表达明显增加（P＜0.05）。与芪连结肠宁中剂量组比较，芪连结肠宁低剂量组TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 和芪连结肠宁高剂量组TLR4、NF-κB p65 mRNA 表达均明显增加（P＜0.01）。 芪连结肠宁低剂量组与模型组间TLR4、NF-κB p65 mRNA 表达比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。芪连结肠宁高剂量组与芪连结肠宁中剂量组间IL-6、TNF-α mRNA表达比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。 详见表4。

2.6 各组大鼠肠道菌群多样性分析

2.6.1 各组大鼠肠道微生物整体信息及OTU 组成 完成25 个样本的多样性数据分析，其中包括正常组、模型组、芪连结肠宁低剂量组、芪连结肠宁中剂量组、芪连结肠宁高剂量组各5 个样本，共获得优化序列1 643 539 个，平均序列长度417 bp。 OTU 序列相似度为0.97，共获得876 个OTU。

2.6.2 Alpha 多样性分析 此次测序发现统计OTU覆盖率均大于99.00%以上，说明本次测序结果代表样本的真实情况，可以进行下一步分析。与正常组相比，模型组大鼠Sobs、Ace、Chao 和Shannon 指数明显降低（P＜0.01），Simpson 指数明显升高（P＜0.05）。与模型组相比，芪连结肠宁中剂量组Sobs、Ace、Shannon 指数明显升高（P＜0.05）。与芪连结肠宁中剂量组相比，芪连结肠宁高剂量组Sobs、Ace、Chao 和Shannon 指数明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；芪连结肠宁低剂量组与芪连结肠宁中剂量组间Sobs、Chao、Ace、Shannon 及Simpson 指数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。 详见表5。

表3 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量比较（±s，pg/mL，n=8）

表3 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量比较（±s，pg/mL，n=8）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与芪连结肠宁中剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别正常组模型组芪连结肠宁低剂量组芪连结肠宁中剂量组芪连结肠宁高剂量组TNF-α 55.51±14.64 369.09±50.80**254.32±30.39#△△110.33±21.59##169.78±26.14##△△IL-6 62.34±11.20 376.36±11.19**322.29±11.83##△△163.28±6.16##224.98±24.39##△TLR4 2.95±1.07 71.76±6.38**55.84±4.61##△△25.19±7.70##42.78±6.18##△NF-κB p65 7.14±1.22 88.23±6.35**60.74±5.68##△△20.32±1.66##41.89±4.51##△△

表4 各组大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表达情况比较（±s，n=8）

表4 各组大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表达情况比较（±s，n=8）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与芪连结肠宁中剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

TNF-α 1.24±0.34 33.32±9.80**44.03±1.06#△△5.78±0.73##14.21±4.18##组别正常组模型组芪连结肠宁低剂量组芪连结肠宁中剂量组芪连结肠宁高剂量组TLR4 1.13±0.29 6.75±1.10**7.89±0.66△△1.67±0.23##5.03±1.47#△△NF-κB p65 1.09±0.31 33.73±3.80**35.50±2.82△△6.82±0.53##15.68±1.53##△△IL-6 1.04±0.09 31.97±2.15**21.71±1.81##△△6.95±0.35##9.06±0.69##

2.6.3 基于OTU 信息的主坐标（principal components analysis, PCoA）及非度量多维尺度（non-metric multidimensional scaling, NMDS）分析 PCoA 得分图中组成差异的解释度值PC1、PC2 值分别为27.36%、13.25%，正常组与其他组样本完全分开，表明在经过造模和灌胃干预之后均对大鼠肠道菌群结构产生一定的影响。 在NMDS 得分图中也可看出芪连结肠宁各剂量组样本都有不同程度向正常组偏移的趋势。 详见图3。

2.6.4 基于门水平下各组大鼠肠道微生物优势物种占比情况 门水平下各组大鼠肠道微生物相对丰度占比前5 的分别是Bacteroidota、Firmicutes、Campilobacterota、Spirochaetota、Desulfobacterota，其余菌门占据比例相对较少。 与正常组相比，模型组Bacteroidota、Campilobacterota 均明显增加（P＜0.05，P＜0.01），Firmicutes 和Spirochaetota 均明显减少（P＜0.05，P＜0.01）。 与模型组相比，芪连结肠宁低剂量组和芪连结肠宁中剂量组Bacteroidota、Campilobacterota 减少（P＜0.05），Firmicutes 及Spirochaetota 明显增加（P＜0.05）。 详见表6、图4。

表5 各组大鼠肠道微生物Sobs、Ace、Chao、Shannon、Simpson 指数比较（±s，n=5）

表5 各组大鼠肠道微生物Sobs、Ace、Chao、Shannon、Simpson 指数比较（±s，n=5）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与芪连结肠宁中剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别正常组模型组芪连结肠宁低剂量组芪连结肠宁中剂量组芪连结肠宁高剂量组Sobs 576.4±39.1 436.2±31.51**491.4±20.12#498±57.66#401.8±48.40△△Ace 643.35±61.23 485.99±31.03**540.44±13.84 563.97±65.38#443.64±45.00△△Chao 659.93±77.87 499.74±44.59**548.27±14.23 556.75±73.69 452.30±47.94△△Shannon 4.425±0.294 3.696±0.305**4.065±0.249 4.167±0.254#3.771±0.509△Simpson 0.036±0.020 0.099±0.053*0.061±0.030 0.044±0.014#0.088±0.052

图3 主坐标及非度量多维尺度分析图

表6 各组大鼠肠道菌群在门水平前5 的相对丰度占比情况（±s，%，n=5）

表6 各组大鼠肠道菌群在门水平前5 的相对丰度占比情况（±s，%，n=5）

注：表中“0”表示物种丰度极小，可以忽略不计。 与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常组模型组芪连结肠宁低剂量组芪连结肠宁中剂量组芪连结肠宁高剂量组Bacteroidota 39.79±10.82 51.57±7.68**46.98±9.02#44.50±10.51#56.14±8.93 Firmicutes 54.27±10.78 42.74±6.92**48.35±7.91#51.02±10.33#41.74±8.67 Campilobacterota 1.16±0.40 2.80±2.55*0.54±0.60#1.00±0.10 0.23±0.24##Spirochaetota 2.36±1.91 0**1.11±1.63#2.14±2.40 0.01±0.03 Desulfobacterota 0.93±0.46 1.35±0.98 1.04±0.70 0.90±0.43 0.35±0.21

图4 各组大鼠肠道菌群门水平群落柱形图

2.6.5 基于属水平下各组大鼠肠道微生物优势物种占比情况 属水平下各组大鼠肠道微生物相对丰度占比前5 的分别是Prevotella、norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f_Lachnospiraceae，其余菌属占比相对较少。与正常组相比，模型组Prevotella 明显增加（P＜0.05），Lactobacillus、norank_f_Muribaculaceae 均明显减少（P＜0.01）。 与模型组比较，芪连结肠宁中剂量组Prevotella明显减少（P＜0.05），norank_f_Muribaculaceae、unclassified_f_Lachnospiraceae 均明显增加（P＜0.01）。详见表7、图5。

3 讨论

UC 属于一种难治性肠道炎症疾病，其发病机制尚不明确，可能与免疫功能、遗传、环境、感染等因素有关[7]。目前，西医主要的治疗药物有氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等，但都存在不同程度的缺陷，且停药或减少用量都有复发和加重病情的风险[8]。 相对而言，中医药治疗UC 具有独特优势。 中医学认为UC 的发病主要以素体脾胃虚弱为基础，兼之感受外邪或饮食、情志失调等诱因合而为病，导致湿、热、瘀、毒、痰等郁结大肠，气血凝滞，肠络损伤，壅为脓血，遂发此病[9]。 基于上述理论所创之芪连结肠宁在临床观察中疗效显著[10]，在动物实验中也具有明显的健脾止泻和促进溃疡恢复等作用[11-12]。方中人参、白术、黄芪、陈皮补气健脾祛湿，黄连、干姜辛开苦降、寒温并用，蒲黄、蒲公英、败酱草、椿皮清热活血、涩肠祛瘀，木香调理肠道气机，白芍酸甘敛阴止痛，甘草调和诸药，全方共奏补脾健胃祛湿、活血拔腐生新、收敛固涩止泻之功效。本实验中UC 模型大鼠在给予不同剂量芪连结肠宁灌胃之后，其DAI 评分均降低，结肠组织病理改变均有不同程度改善，表明芪连结肠宁对于UC 大鼠的结肠损伤具有一定的修复作用。

正常的肠道菌群具有抵抗病原微生物入侵、免疫调节、促营养吸收、调节代谢等作用。 在UC 患者肠道中菌群的多样性会明显减少，与健康人群相比，Firmicutes 比例降低，而变形杆菌和Bacteroidota 比例增加[13]。 相关动物实验研究表明，DSS 诱导的UC模型小鼠Bacteroidota 明显升高、Firmicutes 明显减少，经治疗后可明显增加Firmicutes 并抑制Bacteroidota[14]。本研究结果也显示，模型组大鼠肠道菌群的丰度及多样性均下降，Firmicutes、Spirochaetota 比例下调，Bacteroidota、Campilobacterota 及Desulfobacterota 比例增加；而在经过不同剂量的芪连结肠宁灌胃给药后，其肠道菌群丰度和多样性均有不同程度的恢复，在基于菌群门水平上优势物种的占比与正常组大鼠基本趋于一致，表明芪连结肠宁对UC 肠道菌群具有明显的调节作用，且芪连结肠宁中剂量组具有明显的优势。 肠道菌群紊乱不但表现为有害菌的明显增加，还可表现为有益菌减少，如Firmicutes 中的Lactobacillus 等。 研究发现，Lactobacillus 可以黏附在肠上皮细胞上，防止病原体入侵，对肠黏膜损伤具有保护作用[15]。Lactobacillus 也可与免疫细胞直接相互作用，维持胃肠道免疫功能的平衡。 本次研究发现，模型组大鼠Prevotella 丰度明显增加，而Lactobacillus 丰度明显降低，提示UC 可能与肠道中益生菌和致病菌的动态平衡被打破密切相关。 而芪连结肠宁中剂量组大鼠Prevotella 丰度明显降低，提示不同剂量的芪连结肠宁对于肠道菌群的调控效果可能不一致，值得进一步研究。

表7 各组大鼠肠道菌群在属水平前5 的相对丰度占比情况（±s，%，n=5）

表7 各组大鼠肠道菌群在属水平前5 的相对丰度占比情况（±s，%，n=5）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与芪连结肠宁中剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别正常组模型组芪连结肠宁低剂量组芪连结肠宁中剂量组芪连结肠宁高剂量组Prevotella 10.77±8.21 30.19±9.17*20.02±9.76 15.41±6.50#29.43±9.66△norank_f_Muribaculaceae 23.98±6.29 13.79±2.85**17.06±3.45△22.83±4.25##18.39±3.88 Lactobacillus 15.86±3.32 5.69±7.82**6.22±2.96 7.34±4.32 5.19±2.24 Lachnospiraceae_NK4A136_group 5.57±3.52 5.77±1.99 7.96±7.35 6.64±4.09 1.91±2.49 unclassified_f_Lachnospiraceae 3.31±1.27 3.61±1.34 5.12±2.42 7.09±3.84##4.48±1.65

图5 各组大鼠肠道菌群属水平群落柱形图

近年来，肠道菌群的紊乱与UC 的关系受到越来越多的关注，异常繁殖的肠道致病菌及其衍生代谢物可导致肠道内毒素增多，从而加剧UC 的病理进展[16]。 细菌脂多糖是肠道革兰氏阴性菌外膜的主要成分，具有致炎作用[17]。 当肠道菌群紊乱时，致病菌与益生菌平衡被打破，脂多糖生成增多，参与肠道炎症反应的激活，从而损伤肠黏膜屏障[18]；而损伤的肠黏膜屏障失去保护作用，致使肠道中内毒素越过肠上皮细胞进入外周循环，导致全身的慢性炎症状态，进一步加剧UC[19]。 TLR4/NF-κB 通路的活化是诱发UC 发病重要的信号通路之一[20]。 TLR4 是Toll样受体的重要亚型，可特异性识别细菌脂多糖，参与脂多糖信号传导，介导固有免疫炎症反应，从而调节宿主防御感染、肠内稳态和黏膜先天免疫功能[21]。当脂多糖识别TRL4 后，NF-κB 抑制因子激酶被NFκB 诱导激酶磷酸化，活化的NF-κB 可与基因中κB 序列发生特异性结合，进入核内起始转录，启动和调节TNF-α、IL-6 等炎症因子表达，加剧肠道炎症反应[22]。本次研究发现，经过不同剂量的芪连结肠宁灌胃给药后，UC 大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表达及血清中TLR4、NFκB p65、IL-6、TNF-α 蛋白含量均不同程度降低，提示芪连结肠宁能有效抑制UC 大鼠肠道炎症反应。

综上所述，芪连结肠宁能有效改善UC 大鼠结肠组织病理性损伤，抑制肠道炎症状态，其机制可能与恢复肠道菌群丰度及多样性、调节益生菌与致病菌动态平衡，进而调控肠道炎症相关蛋白通路有关。 当然，此次研究也存在不足，如未检测血清中肠道菌群衍生物相关的内毒素含量，未来还需更加深入的研究。