板枣多糖初级结构表征及抗氧化活性

李 楠 张香飞 杨春杰

板枣，别名稷山板枣，是一种药食兼用果品，主要分布于山西省稷山县，为山西十大名枣之一。板枣果肉厚，肉质致密，甜味浓，汁液较少，多以干制为主，除基本营养物质还含有维生素、糖类、黄酮、多酚、腺苷类、皂甙类等多种植物化学成分[1-3]。

多糖是一类由至少10个单糖缩合而成的高分子物质，具有良好的抗氧化、抗肿瘤、降血糖、免疫调节及促进肠道健康等生物活性[4-5]。研究[6]发现，多糖的生物功能与其单糖组成、分子量、链链相互作用和糖苷键构象等密切相关。目前有关板枣多糖的研究主要集中在测定其多糖含量、优化其提取工艺上，王小媛等[7]以葡萄糖为标准品，通过苯酚—硫酸法测定不同产地红枣的多糖含量，结果显示稷山板枣多糖含量为25.53 g/100 g ·DW；杨萍芳等[8]采用酶法提取稷山板枣多糖，得出酶解温度55 ℃，酶解时间80 min，纤维素酶添加量0.05%时，多糖得率为3.61%。然而，有关板枣多糖的理化性质、单糖组成，光谱学性质，抗氧化活性等研究较少。

研究拟以板枣为原料，采用水提醇沉、脱蛋白、脱色等方法制备板枣多糖，测定其多糖理化参数，利用离子色谱分析其单糖组成，结合紫外和红外光谱分析多糖的初级结构特征，并测定多糖的抗氧化活性，以期为进一步研究板枣多糖结构与其功能活性的关系及天然抗氧化剂的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

板枣：采摘于山西省运城市稷山县；

氢氧化钠、葡萄糖、抗坏血酸、三氯乙酸、无水乙醇、丙酮、考马斯亮兰G250：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

30%过氧化氢、硫酸、苯酚、硫酸亚铁、水杨酸、过硫酸钾、四硼酸钠(硼砂)、乙二胺四乙酸(EDTA)、三氯化铁、碳酸氢钠、硫酸铜、酒石酸钾钠：分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司；

ABTS(2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、3-羟基联苯、牛血清白蛋白：合肥博美生物科技有限责任公司；

1-萘酚、D-半乳糖醛酸、透析袋(截留分子量：3 500)：索莱宝化学试剂有限公司；

单糖标准品：色谱纯，美国Sigma公司。

1.2 主要仪器与设备

傅立叶红外光谱仪：TENSOR 27型，Bruker公司；

双光束紫外可见分光光度计：UV-9000S型，上海元析仪器有限公司；

离子色谱：ICS5000型，赛默飞世尔科技公司；

低速台式离心机：TD6M型，湖南湘立科学仪器有限公司；

冷冻干燥机：SCIENTZ-10N型，宁波新芝生物有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 板枣多糖提取 将板枣去核，60 ℃烘干、粉碎，用石油醚浸泡12 h脱脂，干燥后得脱脂枣粉；然后参照王晓琴等[9]的方法制备板枣粗多糖。配置10 mg/mL的粗多糖溶液，按体积比1∶1加入10%三氯乙酸溶液，振摇30 min 后，冰箱静置12 h， 4 000 r/min离心15 min，取上清液12 mL，用6 mol/L氨水调节pH至9，然后加入30%的过氧化氢1 mL，45 ℃脱色2 h，直至溶液颜色澄清透明[10]；将脱色后的溶液透析3 d，冷冻干燥得板枣多糖。

1.3.2 多糖理化指标测定

(1) 溶解性：分别称取0.5 g多糖放入水、无水乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯中，搅拌，观察多糖的溶解性。

(2) 酯化度：采用化学滴定法[11]。

(3) 颜色反应：碘—碘化钾反应、三氯化铁反应和斐林试剂反应参照戴艳[12]的方法；Molish反应参照王晓琴等[9]的方法；茚三酮反应：取1 mg/mL多糖溶液1 mL，加入茚三酮溶液0.5 mL，沸水浴10 min，观察有无蓝紫色化合物生成。

(4) 总糖含量：采用苯酚硫酸法[13]。

(5) 蛋白质含量：采用考马斯亮蓝法[14]。

(6) 糖醛酸含量：分别移取100 μg/mL半乳糖醛酸溶液 0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL于25 mL比色管中，用蒸馏水补加至1.0 mL。冰水浴冷却后，加入0.012 5 mol/L四硼酸钠—硫酸溶液5 mL，混匀，沸水浴加热5 min，冰水浴冷却后，加入100 μL 0.15%间羟基联苯溶液，混匀，静置5 min，测定524 nm处吸光度，绘制标准曲线[14]。

取质量浓度为50 μg/mL的稷山板枣多糖溶液1 mL，按标准曲线制作方法操作，进行3次平行测定，结果取平均值，代入回归方程求出样品液中半乳糖醛酸的含量，按式(1)计算样品中糖醛酸含量。

(1)

式中：

D——样品中糖醛酸含量，%；

m——样品中半乳糖醛酸质量，μg；

W——样品的质量，μg。

1.3.3 紫外和红外光谱分析 配制1 mg/mL的多糖溶液，以蒸馏水为空白对照，在200～800 nm内进行紫外光谱扫描，观察多糖溶液在260 nm和280 nm处有无核酸和蛋白质吸收峰。取1 mg多糖与100 mg KBr，研磨均匀，压片，在4 000～400 cm-1波数范围内进行红外光谱扫描[15]。

1.3.4 单糖组成分析 单糖组成测定参照Wang等[6]的方法并做修改，称量多糖样品(5±0.05) mg，加入2 mol/L三氟乙酸溶液1 mL，105 ℃加热6 h；氮气吹干；加入甲醇清洗，再吹干，重复2次；加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。离子色谱参数：Dionex CarboPac PA10(250 mm×4.0 mm，10 μm)液相色谱柱，电化学检测器；流动相A为0.1 mol/L NaOH，流动相B为0.1 mol/L NaOH、0.2 mol/L CH3COONa溶液，进样量5 μL，流速0.5 mL/min，柱温30 ℃；梯度洗脱条件：0 min，95%A；30 min，80%A；30.1～45 min，60% A；45.1～60 min，95% A。

1.3.5 抗氧化活性分析

(1) DPPH自由基(DPPH·)清除能力：分别取质量浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的多糖溶液2.0 mL，加入2 mL 0.08 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混匀，25 ℃避光反应30 min，测定517 nm处吸光度[16]。VC作阳性对照。按式(2)计算DPPH·清除率。

(2)

式中：

WDPPH·——DPPH·清除率，%；

Ai，517 nm——测定管吸光度；

Aj，517 nm——乙醇代替DPPH溶液的本底吸光度；

A空白，517 nm——蒸馏水代替样品的空白吸光度。

(2) 羟自由基(·OH)清除能力：参照教小磐等[16]的方法， VC作为阳性对照。

(3) ABTS自由基(ABTS+·)清除能力：ABTS+·工作液的配制方法参照李楠等[17]的方法。分别取0.2 mL 质量浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的多糖溶液，加入4 mL 7 mol/L ABTS+·工作液，混匀，常温避光反应6 min，测定734 nm处吸光度[18]。VC为阳性对照。按式(3)计算ABTS+·清除率。

(3)

式中：

WABTS+·——ABTS+·清除率，%；

Ai，734 nm——测定管吸光度；

Aj，734 nm——蒸馏水代替ABTS+·溶液的本底吸光度；

A空白，734 nm——蒸馏水代替样品的空白吸光度。

2 结果与分析

2.1 溶解度、酯化度、颜色反应

多糖不溶于有机溶剂，如乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯等，难溶于冷水，易溶于常温水和热水。化学滴定法测定其酯化度为64.7%，说明板枣多糖是一种酸性果胶多糖，另外Zhao等[19]测定河北冬枣多糖的酯化度为49%，王晓琴等[9]测定陕西木枣粗多糖的酯化度为38.4%，因此多糖酯化度不仅受到枣果实品种差异的影响，还可能与产地、生长气候、多糖提取方式等因素有关。碘—碘化钾反应阴性，Molish反应阳性，说明板枣多糖不属于淀粉型多糖[20]。三氯化铁反应、茚三酮反应均为阴性，说明板枣多糖不含酚羟基和氨基酸。斐林试剂反应阴性，溶液为浅蓝色无砖红色沉淀，说明板枣多糖无还原糖存在。

2.2 总糖、蛋白质和糖醛酸含量

经测定，板枣多糖的总糖含量为52.30%，蛋白质含量为0.90%。由图1可知，半乳糖醛酸在质量浓度0～80 μg/mL 范围内线性关系较好，多糖中糖醛酸含量较高，为46.22%。综上，板枣多糖是一种果胶多糖。

2.3 光谱分析

2.3.1 紫外光谱分析 由图2可知，板枣多糖在260 nm处无吸收峰，说明其不含核酸；在280 nm处有较弱的蛋白质吸收峰，与多糖中蛋白质含量为0.90%的测定结果相符合，说明多糖中几乎不含蛋白质。

2.4 单糖组成分析

图4为单糖标准品和多糖样品的离子色谱图。根据单糖标准品的保留时间确定板枣多糖中单糖的种类，利用不同浓度单糖标准品的峰面积绘制标准曲线，根据样品峰面积确定单糖含量。由表1可知，半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖在板枣多糖中含量较高，葡萄糖、鼠李糖、木糖和甘露糖含量次之，还有较低含量的葡萄糖醛酸、岩藻糖和盐酸氨基葡萄糖，说明板枣多糖是一类组成复杂的杂多糖，与袁月鹏[23]的研究结果一致。板枣多糖中半乳糖醛酸含量较高，为141.96 μg/mg，推测其为果胶多糖，Chang等[24]对台湾大枣粗多糖的单糖组成进行了分析，结果为粗多糖中半乳糖醛酸含量占比70.8%，二者研究结果一致。有研究[25]表明，糖醛酸含量高的多糖其生物活性会更强，因为糖醛酸残基可以使多糖化学特性和溶解性发生改变。板枣多糖含有较高的糖醛酸，因此其生物活性可能较高。

图1 半乳糖醛酸标准曲线Figure 1 Standard curve of galacturonic acid

图2 板枣多糖紫外光谱图Figure 2 UV spectra of polysaccharide from Z. jujuba cv. Banzao

图3 板枣多糖红外光谱图Figure 3 FT-IR spectrum of polysaccharide from Z. jujuba cv. Banzao

1. 岩藻糖 2. D-氨基半乳糖盐酸盐 3. 鼠李糖 4. 阿拉伯糖 5. 盐酸氨基葡萄糖 6. 半乳糖 7. 葡萄糖 8. 木糖 9. 甘露糖 10. 果糖 11. 核糖 12. 半乳糖醛酸 13. 古罗糖醛酸 14. 葡萄糖醛酸 15. 甘露糖醛酸图4 单糖混标和多糖的离子色谱图Figure 4 Ion chromatograms of standard monosaccharide mixture and the polysaccharide

2.5 抗氧化活性分析

由图5可知，板枣多糖可以清除DPPH·、·OH和ABTS+·，且成剂量依赖性。当多糖质量浓度相同时，对自由基清除率大小为： DPPH·>·OH> ABTS+·。

当板枣多糖质量浓度为1.0 mg/mL时，对DPPH·的清除率为23.64%，而王晓琴等[9]的研究结果表明，1.0 mg/mL 的木枣多糖对DPPH·的清除率小于20%，原因可能是板枣多糖含有较多的半乳糖醛酸，高含量的半乳糖醛酸有助于提高多糖的抗氧化活性[25]。

当质量浓度为1.0 mg/mL时，板枣多糖对·OH清除率为21.01%，而0.05 mg/mL的 VC对·OH的清除率为18.28%，所以板枣多糖有较强的·OH清除能力，可以通过加大多糖剂量达到与VC对·OH的清除能力。

当多糖质量浓度为1.0 mg/mL时，对ABTS+·的清除率为13.84%，低于0.02 mg/mL的VC对ABTS+·的清除率(20.28%)。因此，板枣多糖对ABTS+·的清除能力相对较弱。板枣多糖对不同自由基的清除能力不同，可能与多糖的单糖组成、结构及分子量大小有关。

表1 板枣多糖中单糖种类及含量Table 1 Types and contents of monosaccharide in from polysaccharide of Z. jujube cv. Banzaoμg/mg

图5 多糖对自由基的清除能力Figure 5 The free-radical scavenging activity of polysaccharide

图6 抗坏血酸(VC)对自由基的清除能力Figure 6 The free-radical scavenging activity of VC

3 结论

以稷山板枣为原料，经水提醇沉、脱蛋白、脱色得到板枣多糖，经测定，板枣多糖总糖含量52.30%，糖醛酸含量46.22%，酯化度为64.7%，说明板枣多糖是一种酸性果胶多糖。多糖用三氟乙酸水解后进行离子色谱测定，得知板枣多糖是一类组成复杂的杂多糖，其主要单糖组成为半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖和甘露糖，其中半乳糖醛酸含量最高，为141.96 μg/mg。傅里叶变换红外光谱显示，板枣多糖具有多糖的特征吸收峰，是含有α-糖苷键的吡喃糖。抗氧化活性结果表明，板枣多糖可以清除DPPH自由基、羟自由基和ABTS自由基且呈剂量依赖性。后续将进一步评价板枣多糖的体内抗氧化活性并深入研究其构效关系及抗氧化活性作用机制。