艾灸对D-半乳糖致亚急性衰老模型大鼠皮肤氧化应激及血清IL-6的影响

王彩霞

宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004

皮肤衰老是一个复杂的生命现象，在皮肤老化过程中会发生一系列生物学改变，如皮肤及皮下组织成分减少和免疫系统改变。皮肤老化不仅引起皮肤功能减退有损于容颜，还可能影响到人的生理、心理，同时与许多皮肤病如脂溢性皮炎、日光性角化病、基底细胞癌、鳞状细胞癌的发生也有着病因学关系[1]。因此，预防和延缓皮肤衰老已成为美容医学的研究热点之一。目前临床上常用的抗皮肤衰老药物有：维生素C、E、辅酶Q等。此外，注射肉毒素、皮肤提紧术、激光治疗、自体脂肪填充术等也作为对抗皮肤衰老的手段，但有一定的风险及副作用。

中医保健抗衰老历史悠久，早在两千多年前的医学著作《黄帝内经》中就有关于艾灸延缓衰老的详细记载。现代研究[2]表明，艾灸可通过清除氧自由基、提高免疫功能、调整脂质代谢、调节内分泌等途径以达到延缓衰老的目的，其中以清除氧自由基，调节氧化应激紊乱为首要。本研究通过观察艾灸“足三里”“关元”穴对衰老模型大鼠皮肤组织中氧化指标超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及血清白介素-6的影响，从而探讨其抗衰老作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠40只，雌性，体重(200±20)g，级别：SPF。实验动物均购自宁夏医科大学实验动物中心。

1.1.2 药品、试剂与仪器 艾条(北京国医研医药技术开发有限公司)；维生素E(北京绿健园科技有限公司)。D-半乳糖生化试剂(源叶生物)，SOD、MDA、IL-6测定试剂盒(均由Elabscience公司提供)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Elabscience公司)。ICV-450电热恒温培养箱(日本ASONE)，INFINITE E PLEX型酶标仪(Tecan Austria GmbH公司)，H1650-W台式微量高速离心机(湖南湘仪)，D1008E型涡旋仪(D1008E公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 40只受试动物适应性饲养1周后随机分为4组，每组10只：分别为正常组、模型组、阳性对照组(维生素E组)和艾灸组，所有动物在统一条件下标准饲料喂养，自由饮水。

1.2.2 动物造模与艾灸干预 除正常组外，每日给予造模大鼠(模型组、阳性对照组、艾灸组)颈背部皮下注射10%D-半乳糖(1000 mg·kg-1·d-1)，连续注射 6 周，造成亚急性衰老模型[3]。从注射的第22天开始艾灸治疗。每日给药造模后将大鼠用固定器固定，参照余曙光等[4]编写的《实验针灸学》进行定位取穴(关元位于脐下约25 mm处；足三里位于膝关节后外侧，腓骨小头下方约5 mm处)，对足三里和关元穴施温和灸(以大鼠无剧烈嘶吼、挣扎为度)，每穴灸5 min，施灸前将穴区部位的毛剪干净，灸后局部皮肤潮红，不起泡。除艾灸组外，其余各组每天同一时间相同固定5 min，不做艾灸治疗，亦不让其闻到艾烟味。正常组颈背部皮下注射同等剂量0.9%生理盐水，阳性对照组颈背部涂抹维生素E软胶囊。每日1次，共治疗21 d。

1.3 标本采集

1.3.1 血清标本采集 治疗结束1 h后，用10%水合氯醛(3.5 mL·kg-1)对大鼠进行腹腔注射麻醉，用心脏采血法采集大鼠血液，静置30 min，用离心机(3000 r/min )离心10 min后分离血清，取血清分装，并在-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 皮肤组织采集 取材当天取脱毛后的背部皮肤组织约0.5 g，经预冷生理盐水漂洗，并除去皮下脂肪和其他结缔组织，滤纸拭干后称重，取9 倍质量的预冷生理盐水制成10%组织匀浆。匀浆液以3500 r/min的速度离心20 min，取上清液。分别按照试剂盒说明书检测皮肤组织SOD活性、MDA含量和血清IL-6水平。

1.4 数据处理 应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，实验数据用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

由表1可知艾灸对大鼠皮肤组织中SOD活性、MDA含量和血清IL-6水平的影响，与正常组比较，模型组大鼠皮肤组织SOD活性显著降低，MDA含量明显升高，血清IL-6水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，艾灸可增强大鼠皮肤SOD活性，降低MDA含量，降低血清IL-6水平(P<0.01)。

表1 艾灸对大鼠皮肤组织中SOD活性、MDA含量及血清IL-6水平的影响

3 讨论

机体衰老是生命过程的必然规律，是一个全方位、多因素作用的复杂过程，常伴随着结构退行性变化和机能衰退[5]。皮肤位于机体最外层，是人体最大的器官，具有调节水分、阻止病原体入侵和防止电解质流失等作用，其衰老程度直接反映机体的老化水平[6]。衰老的皮肤临床表现为皮肤松弛变薄、弹性降低、干燥粗糙、出现色素沉着和产生皱纹等特征[7]。皮肤衰老一般由内源性因素和外源性因素引起[8]，前者属于自然老化，与年龄有关，受遗传基因调控和氧化损伤作用影响，又称为固有性老化；后者则大多与环境有关，与人类关系最为密切的就是紫外线辐射，即光老化[9-10]。据目前文献[11]报道，皮肤衰老与氧自由基增多、免疫力减退、胶原降解增加、端粒酶活性降低和炎性浸润等有关。

D-半乳糖是机体正常营养物质，但连续给动物注射D-半乳糖，就会造成细胞内半乳糖浓度持续增高，细胞内醛糖还原酶将其还原为不能正常代谢的半乳糖醇，而半乳糖醇一旦在体内堆积就会使细胞内渗透压升高，同时可引起氧化应激，导致细胞肿胀、功能受损，代谢紊乱，致使机体多系统、多器官功能减退，最终导致衰老[12-13]。本实验采用了D-半乳糖所致的大鼠衰老模型，该模型造模时间短，成模率高，且模型稳定，而且部分指标接近于自然衰老，因此得到广泛应用。

自由基-氧化应激学说是在自由基学说基础上发展而成的，为诸多学说的中心[14]。自由基产生过量，尤其是活性氧自由基(ROS)堆积，可与细胞膜中的不饱和脂肪酸发生作用，形成脂质自由基，它对生物膜脂结构的破坏性极强，使蛋白质(酶)变性，导致机体氧化和抗氧化平衡体系遭到破坏，从而产生氧化应激，造成机体衰老[15]。正常情况下，机体内存在清除氧自由基的防御系统，包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶及维生素A、C、E等抗氧化物质。随着年龄的增长，机体抗氧化酶活性下降，抗氧化物质合成减少，导致清除氧自由基的能力下降，从而产生大量代谢产物丙二醛(MDA)。因此，MDA是衡量体内自由基代谢的敏感指标，间接反映机体衰老[16]。SOD 可通过酶的水解反应清除氧自由基，其活力高低是反映机体抗氧化能力的重要指标[17-18]。IL-6是一种多功能的细胞因子，由单核巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生，在炎症反应和免疫应答中起重要作用[19]。研究显示，在多种不同种属的动物衰老过程中，血清IL-6水平升高。IL-6的增龄性升高可能是对一系列长期慢性应激如炎症、氧化、免疫应急等适应性改变的结果。IL-6与IL-6受体结合后，可在机体内产生多种生物学活性，比如影响细胞生长，促进细胞分化等[20]。因此，血清IL-6水平的高低可作为个体化衰老的良好指标。在本实验中艾灸能显著降低大鼠血清IL-6水平，提示艾灸能有效增强衰老大鼠的免疫功能，有助于促进细胞分裂增殖。

“关元”和“足三里”是防病抗衰老的重要穴位，有“长寿穴”和“保健穴”之称。“关元”穴位于任脉，是足三阴经与任脉的交会穴，联系命门真阳，是一身元气之所在，为阴中之阳穴，属先天之本，具有培补元气、补益精血、调理冲任之功，艾灸关元穴可补摄下焦元气，固护机体元阴元阳[21]。“足三里”是足阳明胃经合穴，胃之下合穴，为回阳九针穴之一，是土经中的土穴，属后天之本，具有健运脾胃、培土化元、益气养血之功，是治疗诸虚百损的常用穴[22]。本实验选用艾灸关元穴和双侧足三里穴，两穴配合共同起到调节阴阳平衡的作用，使先天之本与后天之本有机结合，共奏培元固本、益气活血、健脾补肾、益寿延年之功，从而达到保卫正气、防病抗衰的目的[23]。本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠皮肤中SOD活性显著降低，MDA含量显著升高，血清IL-6水平显著升高。与模型组比较，艾灸组皮肤中MDA含量降低，SOD活性增强，表明艾灸可通过降低皮肤MDA含量，增强SOD活性，降低血清IL-6水平从而起到抗皮肤衰老的作用。

综上，艾灸具有抗皮肤衰老作用，其作用机制可能与增强皮肤抗氧化能力，减少皮肤组织氧自由基含量，调节血清免疫因子水平有关。