外用烫疗药对小鼠的抗炎镇痛作用研究*

黄 蓓 陈 锋△ 杨 柯 杨 磊 李润强

（1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200）

炎性疼痛（inflammatorypain）系在无外部触发因素下的自发性疼痛，是临床常见的病理性疼痛，骨关节炎痛、跌打肿痛炎症产生的疼痛则是骨组织、肌肉组织炎症病变引起的疼痛，是慢性炎性痛的易发部位。目前，炎性疼痛治疗临床多用抑制疼痛的西药，一类为麻醉性镇痛药物，镇痛效果虽好，但抗炎作用并不理想，且长期使用副作用较大［1］；另一类为非甾体类解热镇痛药物，但主要用来治疗轻中度疼痛，对炎性痛的缓解和治疗效果并不好，且存在肾损害、抗血小板凝聚、水肿、诱发消化道溃疡等诸多不良反应［2］。传统中药复方有着多靶点、不良反应少等独特优势，为炎性疼痛的治疗提供了新的选择。近年来，运用中药热熨治疗骨伤科炎性疼痛特别是寒性炎痛有很多成功病例［3-9］。

“烫疗药”是由笔者所在医院全国名老中医、全国名老中医药专家第二批带徒导师李桂文教授拟方的院内中药制剂，具有独特的壮瑶医特色。烫疗药属于典型的中药热熨制剂，用时可反复蒸热熨烫敷于患处，也可置热跌打药酒中反复烫洗。全方具活血化瘀、温通经脉、抗炎镇痛止痹之功，可用于骨关节炎痛、风湿骨痛、坐骨神经痛、跌打肿痛、腰及颈椎增生引起的疼痛等［10-13］。本研究通过小鼠热板法、小鼠扭体法、小鼠耳郭肿胀法、小鼠足跖肿胀法、小鼠棉球植入法［14］，研究烫疗药镇痛和抗炎作用，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级KM小鼠，体质量（20±2）g，雌雄兼用，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。标准条件饲养1周，自由进食、饮水，环境温度（22±2）℃、相对湿度65%～70%，人工黑暗和光照交替，使用许可证号：SYXK（桂）2019-0001。

1.2 实验药物

烫疗药（宽筋藤、大黄、大驳骨、苏木、桂枝、川乌、草乌、大罗伞、小罗伞、续断、姜黄、骨碎补、艾叶、泽兰、防风），将药材加适量蒸馏水煎煮20 min，过滤，浓缩得0.6 g/mL的棕黄色药液，待药液冷却后置于4℃冰箱保存备用。由广西中医药大学附属瑞康医院药物研发中心自制，规格：150 g/包，批准文号：桂药制字Z01060103。生产批号：20201009）。双氯芬酸二乙胺乳胶剂（扶他林，GSK Consumer Healthcare Schweiz AG，2X8C）。

1.3 试剂与仪器

0.9%氯化钠注射液（回音必集团江西东亚制药有限公司，2020060117）；75%酒精（武汉市雪环医用消毒用品有限公司，20210101）；冰乙酸（成都市科隆化学品有限公司，2018071701）；二甲苯溶液（成都市科隆化学品有限公司，2020042101）；复方醋酸地塞米松乳膏（华润三九医药股份有限公司，2019016X）；注射用青霉素钠（江西省科达动物药业有限公司，20210427）；水合氯醛（成都市科隆化学品有限公司，2018091101）。热板仪（RB-200智能热板仪）、BSA223S万分之一天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）、PV-200足跖容积测量仪（成都泰盟软件有限公司）、MLS-3781L-PC（高压蒸汽灭菌器）、101-1型电热鼓风干燥箱恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.4 热板实验

1.4.1 动物筛选 将热板仪调至（55±0.5）℃，将雌性小鼠置于热板上，密切观察小鼠反应，以舔后足为痛觉敏感指标。秒表记录从将小鼠置于热板上到出现舔后足的时间，共两次，每次间隔5 min，取其均值为该小鼠的痛阈值。痛觉反应过敏（跳跃、逃窜或痛阈值小于10 s）或痛反应迟钝（痛阈值大于30 s）的小鼠弃去不用，筛选出其他符合要求的动物进行实验。

1.4.2 分组与给药 将筛选合格的60只雌性KM小鼠按痛阈值分为5组，即空白对照组，阳性对照组，烫疗药高、中、低剂量组，每组12只。空白对照组、阳性对照组小鼠脚掌分别涂抹0.9%氯化钠注射液0.1 mL、扶他林0.1 mg，每日1次，连续7 d给药。烫疗药组用烫疗药药液50 mL将医用纱布浸润后平铺于干净饲养盒中，将动物置于盒中自由活动30 min，烫疗药低剂量组每天1次，中剂量组每天2次，高剂量组每天3次，连续7 d。分别在给药后第2日、第4日、第7日，用热板法依次测定各鼠痛阈值2次（每次间隔2 h），如小鼠60 s内仍未产生疼痛反应，应立即取出不再刺激，痛阈值按60 s计算。镇痛率（%）=（用药组平均痛阈值-空白对照组平均痛阈值）÷空白对照组平均痛阈值×100%。

1.5 扭体实验

取健康KM小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组，分组及给药方法同热板法，末次给药24 h后，每只小鼠注射0.6%冰醋酸0.2 mL/10 g，观察10 min内扭体反应次数。镇痛率（%）=（空白对照组扭体次数-给药组扭体次数）÷空白对照组扭体次数×100%

1.6 耳郭肿胀实验

取健康KM小鼠70只，雌雄兼用，按体质量随机分为5组，即空白对照组，阳性对照组，烫疗药高、中、低剂量组，每组14只（雌性6只，雄性8只）。空白对照组和阳性对照组小鼠右耳外耳郭中央分别涂抹0.9%氯化钠注射液0.1 mL、复方醋酸地塞米松乳膏0.1 mg，每日1次，连续7 d。烫疗药组小鼠右耳外耳郭中央涂抹烫疗药药液0.1 mL，低剂量组每天1次，中剂量组每天2次，高剂量组每天3次，连续7 d。末次给药后24 h，在小鼠左右耳外耳郭的中央分别滴加二甲苯20 μL，1 h后将小鼠脱颈椎处死，剪下双耳，用8 mm直径打孔器在两耳相同部位打下耳片并称重。耳郭肿胀率（%）=（右耳耳片重-左耳耳片重）÷左耳耳片重×100%

1.7 足跖肿胀实验

将健康KM小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组，即空白对照组，阳性对照组，烫疗药高、中、低剂量组，每组12只。分别在每只小鼠右后肢踝关节处画上闭合的标记线，用足跖容积测量仪测得小鼠平齐标记线下的足跖体积作为致炎前足跖容积。空白对照组、阳性对照组小鼠右后肢踝关节处涂抹0.9%氯化钠注射液0.1 mL、复方醋酸地塞米松乳膏0.1 mg，每日1次，连续7 d。烫疗药组小鼠右后肢踝关节处涂抹烫疗药药液0.1 mL，低剂量组每天1次，中剂量组每天2次，高剂量组每天3次，连续7 d。末次给药后24 h，在每只小鼠右后足跖向脚掌处注射新鲜鸡蛋清0.1 mL，分别于1、2、4、6 h同一部位测2次小鼠足跖容积，取平均值作为致炎后足跖容积。足跖肿胀率（%）=（致炎后足跖容积-致炎前足跖容积）÷致炎前足跖容积×100%

1.8 棉球植入实验

将脱脂棉制成约10 mg紧致的小棉球，高压灭菌后置于恒温干燥箱60℃干燥3 h后保存备用。将健康KM小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组，即空白对照组，阳性对照组，烫疗药高、中、低剂量组，每组12只。每只小鼠经10%水合氯醛（0.1 mL/只）麻醉后，75%酒精消毒，在无菌条件下切开小鼠背部皮肤，向左右腋下各植入棉球1个，缝合切口，术后每只小鼠连续3 d注射青霉素（0.2 mL/只，8万单位）。空白对照组、阳性对照组小鼠脚掌处分别涂抹0.9%氯化钠注射液0.1 mL、复方醋酸地塞米松乳膏0.1 mg，每日1次，连续14 d；烫疗药组小鼠给药方法同热板法烫疗药组给药方法，连续14 d。末次给药24 h后，将小鼠脱颈椎处死，剪开皮肤，剥取带肉芽组织的棉球，于恒温干燥箱60℃干燥1 h后称重。肉芽肿净量（mg）=干燥后棉球肉芽肿重量-原棉球重量。棉球肉芽抑制率（%）=（空白对照组肉芽肿净量-给药组肉芽肿净重）÷空白对照组肉芽肿净重×100%

1.9 统计学处理

应用SPSS22.0统计软件。实验数据结果以（）表示，对数据进行t检验作组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠痛阈值及镇痛率的比较

见表1。与空白对照组相比，烫疗药高、中、低剂量组在给药的第2、4、7日均可一定程度延长小鼠痛阈值，且中剂量连续给药7 d可明显提高小鼠的痛阈值（P＜0.05），镇痛率达79.73%，表明烫疗药对热所致疼痛有镇痛效果。烫疗药各剂量组间及与阳性对照组间比较无显著差异（P＞0.05）。

表1 各组小鼠痛阈值及镇痛率的比较（±s）

表1 各组小鼠痛阈值及镇痛率的比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组 别n 给药前痛阈值（s）给药后第2日痛阈值（s） 镇痛率（%）给药后第4日痛阈值（s） 镇痛率（%）给药后第7日痛阈值（s） 镇痛率（%）12 12 12 12 12空白对照组阳性对照组烫疗药低剂量组烫疗药中剂量组烫疗药高剂量组21.05±5.63 24.05±6.16 22.10±5.89 20.99±6.15 23.10±5.69 15.85±3.09 20.17±5.87*17.19±5.47 16.82±5.28 19.16±8.48-27.29 8.50 6.15 20.92 14.52±6.24 15.53±5.18 14.89±4.02 13.30±2.75 18.89±9.41-6.96 2.52-8.43 30.09 14.22±4.16 14.82±5.70 16.71±6.59 25.55±15.11*15.14±6.20-4.29 17.56 79.73 6.52

2.2 各组小鼠扭体次数的比较

见表2。与空白对照组相比，烫疗药各剂量组小鼠扭体次数均显著降低（P＜0.05），且镇痛率与给药次数相关；与阳性对照组相比，烫疗药高剂量组小鼠的扭体次数显著减少（P＜0.01），且镇痛率达77.78%，表明烫疗药对冰醋酸所致疼痛具有良好的镇痛效果。各烫疗组间比较无显著差异（P＞0.05）。

表2 各组小鼠扭体次数及镇痛率的比较（±s）

表2 各组小鼠扭体次数及镇痛率的比较（±s）

组 别n 扭体次数（次） 镇痛率（%）空白对照组阳性对照组烫疗药低剂量组烫疗药中剂量组烫疗药高剂量组12 12 12 12 12 18.75±6.70 12.42±5.68*12.18±7.15*9.83±6.07**4.17±5.08**△-33.78 35.11 47.56 77.78

2.3 各组小鼠耳郭肿胀情况比较

见表3。与空白对照组比较，烫疗药各剂量均能引起二甲苯致小鼠耳郭肿胀度、耳郭肿胀率明显升高（P＜0.05或P＜0.01），提示烫疗药对二甲苯所致的小鼠耳郭肿胀没有明显的抑制作用。烫疗药各剂量组间及与阳性对照组间比较无显著差异（P＞0.05）。

表3 各组小鼠耳郭肿胀情况比较（±s）

表3 各组小鼠耳郭肿胀情况比较（±s）

组别空白对照组阳性对照组烫疗药低剂量组烫疗药中剂量组烫疗药高剂量组n 14 14 14 14 14耳郭肿胀度（mg）1.44±1.68 2.81±2.98 2.81±1.71*3.67±2.48*4.17±2.53**耳郭肿胀率（%）20.74 51.02 35.25 44.67 51.14

2.4 各组小鼠足跖肿胀情况比较

见表4。与空白对照组比较，给予烫疗药1 h后开始显著降低鸡蛋清所致小鼠足跖容积和足跖肿胀率的升高（P＜0.05～0.01），高、中剂量药效可维持4h，低剂量可维持2 h。烫疗药各组小鼠的足趾肿胀率与给药次数呈量效关系，表明烫疗药对鸡蛋清致炎作用具有明显抑制作用。与阳性对照组比较，烫疗药低剂量组给药6 h后，小鼠足跖肿胀度升高有显著差异（P＜0.01），烫疗药各剂量组间无显著差异（P＞0.05）。

表4 各组小鼠足趾肿胀情况的比较

2.5 各组小鼠肉芽组织增生的比较

见表5。与空白对照组相比，烫疗药中剂量组可显著减少小鼠棉球肉芽肿组织增生（P＜0.01），抑制率达36.94%，高、低剂量有一定程度减少小鼠棉球肉芽肿组织增生作用，表明烫疗药对小鼠棉球肉芽肿增生具有明显抑制作用。烫疗药各剂量组间及与阳性对照组间比较无显著差异（P＞0.05）。

表5 各组小鼠肉芽肿情况的比较

3 讨论

在镇痛实验中，通过热板法可知烫疗药各剂量组在给药的第2、4、7日均可延长小鼠痛阈值，其中烫疗药中剂量组在给药的第7日明显提高了小鼠的痛阈值；通过扭体法可知烫疗药各剂量组均不同程度地显著减少小鼠的扭体次数，镇痛率与给药次数呈正相关。抗炎实验中，烫疗药各剂量组对二甲苯致小鼠耳郭肿胀度均有明显升高；烫疗药各剂量给药后1 h对新鲜鸡蛋清所致小鼠足跖容积和足跖肿胀率明显降低，高、中剂量药效可维持4 h，低剂量可维持2 h；烫疗药各剂量组小鼠棉球肉芽肿净量明显降低，其中烫疗药中剂量组效果最显著。以上结果表明烫疗药在镇痛方面，对冰醋酸诱发的炎性疼痛具有较好的镇痛效果；在抗炎作用方面，烫疗药对急性渗出性炎性水肿无明显抑制作用，对鸡蛋清所致小鼠急性足趾肿胀具有较好的抑制作用，对炎症后期肉芽组织增生具有明显抑制作用。

烫疗药抗炎镇痛作用可能与热敏通道TRP有关。TRP介导多种急慢性炎症疼痛，除了温度和机械刺激，多种辛味中药如吴茱萸、白芥子、生姜、肉桂、大蒜、白芷等的活性成分，以及内源性H+及炎症介质都能够激活热敏通道［15］。当组织受损伤时，受损伤细胞会释放大量的炎性介质，如H+、K+、缓激肽、组胺、ATP、5-HT和NO等，内源性炎性介质通过多种信号通路进一步激活热敏通道而引起疼痛［16］，这种情况称为区域敏化。在激动剂、温度和炎症等相关因素的综合作用下，热敏通道致敏，产生炎症病理证候。有学者的相关研究也证实了关节炎性小鼠在后期表现出机械性痛觉过敏减轻与TRPV1通道缺失有关［17］。烫疗药可能正是应用TRPV1、TRPA1作用机制，通过减少炎性介质的产生，抑制TRP激动剂炎性因子的活性，脱敏TRP通道，起到抗炎镇痛的作用，另外处方里温热药本身所含的TRPV1激动剂和烫疗药热熨时的较高温度激活TRPV1通道，产生热感；达到一定条件后，抑制低温及炎性因子等TRPA1激动剂的活性，交叉脱敏TRPA1通道，从而消除低温及炎症诱发的冷痛，发挥散寒止痛的作用，关于烫疗药抗炎镇痛的作用分子机理还有待进一步的研究。

烫疗药以瑶药宽筋藤（青坐翁）、大驳骨祛风止痛、舒筋活络为君，臣以壮药大罗伞、小罗伞祛风湿、止痹痛；佐以川乌、草乌、防风祛风湿，温经止痛；艾叶温经散寒止痛；骨碎补、续断续筋接骨、补肾强骨；大黄、苏木、泽兰、姜黄活血化瘀止痛，体现“治风先治血，血行风自灭”的治疗理念，活血化瘀药与温经散寒药合用，使血得温则行，血行瘀消，诸症自愈。全方共奏活血祛瘀、解痉止痛之功。中药烫疗经过加热外熨敷于患收，药力经皮入肉、从筋至骨、从外到内，起到温经通络、祛风散寒的功效，从而更好地发挥其活血化瘀、舒筋活络、消肿止痛的作用。