对叔丁基邻苯二酚抑藻效果及毒性应用研究

陈宏伟，王志红，仇永婷，刘立凡

（1.深圳市水务（集团）有限公司，广东 深圳 518000;2.广东工业大学 土木与交通工程学院，广东 广州 510000）

0 引言

化感作用是指由植物、细菌等所产生的二次代谢产物影响生态系统中一些生物的生长和发育的现象，这些代谢产物被称为化感物质[1]。基于化感作用治理富营养化水体因其高效性、环境友好性等优势受到国内外研究人员的关注，是目前水环境领域的研究热点。四尾栅藻与水华微囊藻共培时，通过释放酚酸类化感物质对叔丁基邻苯二酚（TBC）来抑制水华微囊藻的生长，维持自身的竞争优势，谭凯婷等[2]研究发现，实验室条件下，TBC 对铜绿微囊藻也拥有显著的抑制效果。但目前对该化感物质抑藻的研究多集中在实验室配置的培养液条件下，对自然水体环境下的抑藻效果研究较少，且以上研究仅针对TBC 对单一藻类的抑制效果，无法全面反映其实际应用前景。为此，分别选取以蓝藻为主的广州大学城中心湖（以下简称中心湖）、以绿藻为主的华南理工大学景观湖水体（以下简称华工湖）及蓝藻、绿藻占比均等的广东工业大学行政楼景观湖水体（以下简称广工湖）3 种典型自然水体作为研究对象，研究不同浓度的TBC 对自然水体中藻类的抑制效果、生物毒性及降解产物，以期使我国的化感抑藻技术尽快成熟和推广应用。

1 试验方法及材料

1.1 试验方法

（1）TBC 对3 种典型自然水体的抑藻效果试验

分别从广州大学城中心湖、华工湖及广工湖水体中采样后将2.0 L 试验水样装入容量为2.5 L的烧杯中，再将水样中TBC 质量浓度分别设置为0，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0 及5.0 mg/L，培养条件尽量还原我国南方夏季典型藻华爆发高峰期的环境参数，选用自然光照，试验期间测定光照度范围为2 500 ± 500 lx，光暗比为12 h ∶12 h，温度范围为30 ～35 ℃，试验周期为15 d。每组设置3 个平行样，培养过程中用玻璃棒每天搅动3 次，同时调换烧杯位置。以上水样分别在第0，1，2，4，7，10 和15 天时定期取样，检测并记录各组水样中藻类的叶绿素浓度数据。

（2）TBC 的生物毒性试验

受试生物选用大型溞，试验在150 mL 烧杯中进行。以蒸馏水、中心湖、华工湖及广工湖原水为试验水样，将水样中TBC 质量浓度分别设置为0，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0 及5.0 mg/L，每个水样中投入10 个大型溞，每组设置3 个平行样，试验过程中定期观察并及时移除死掉的受试生物以避免对水体造成污染。设置光照度范围为2 500 ± 500 lx，光暗比为12 h ∶12 h，温度范围为30 ～35 ℃，试验周期为96 h。

（3）TBC 的降解产物研究试验

以蒸馏水、中心湖、华工湖及广工湖原水为试验水样，设置水样中TBC 质量浓度为2.0 mg/L。光照度范围为2 500±500 lx，光暗比为12 h ∶12 h，温度范围为30 ～35 ℃，每组设置3 个平行样。以上水样分别在第0，1，2，4，6，8 和10 天时定期取样并检测各水样中的降解产物类型。

1.2 试验材料

（1）试验水样

试验用水样分别取自中心湖、华工湖、广工湖。设置3 组重复试验，取水日期分别为3月15日（温度为15 ～23 ℃，第1 批）、7月20日（温度为26 ～33 ℃，第2 批）及8月30日（温度为25 ～31 ℃，第3 批）。所取水样经实验室采用藻类分析仪（Algae Lab Analyser bbe）分析后，3 种自然水体内藻华种类的占比见表1。

表1 3 种典型自然水体中藻类占比

由于气候等条件的差别，3 批自然水体中藻类占比数值也存在差别，但各水体中优势藻种类相同。由表1 可以看出，中心湖水体中优势藻为蓝藻，3 次取样蓝藻在总藻中占比分别为58.23%，90.24%及65.22%，平均占比为71.23%；华工湖水体中优势藻为绿藻，3 次取样中绿藻在总藻中占比分别为98.11%，88.62%及80.31%，平均占比为89.01%；广工湖水体中蓝藻、绿藻含量基本相当，3 次取样蓝藻、绿藻占比均为16% ～20%。3 种水体各具代表性，为研究TBC 对不同自然水体的抑藻效果提供了典型案例。

为观察水体中的藻细胞种类，将3 种自然水样分别用蒸馏水稀释10 倍后，吸取25 μL 滴入藻类计数框放在显微镜下进行镜检发现，水体中蓝藻主要包括微囊藻属、鱼腥藻属、束丝藻属，绿藻主要包括栅藻属、小球藻属和十字藻属，硅藻主要为直链藻属。经对比相关文献，该原水特征与我国南方主要淡水水体中藻类种群特征类似[3-4]。

（2）毒理试验生物

大型溞购自广州光大藻种，取大型溞第3 ～6天时成溞产的幼体溞作为试验材料。试验开始前，在实验室自然光照与温度下驯养7 d 以上及自然死亡率小于0.5%时符合试验要求。饲以斜生栅藻，试验前1 d 停止喂食，试验期间也不喂食。

1.3 降解产物检测方法

采用甲苯为有机萃取剂，将待测样品用0.45 μm 水系微孔滤膜过滤后，再将20 mL 甲苯分4次萃取20 mL 滤液，最后将萃取液通过0.45 μm有机系微孔滤膜过滤后，采用美国Thermo Fisher公司的超高分辨四极杆组合静电场轨道阱液质联用仪进行检测。检测条件见表2。

表2 检测条件

1.4 数据分析

（1）LC5024h及LC5048h拟合

采用SPSS 20.0 软件研究不同水体中TBC 投加量与受试生物累计致死率的关系，以TBC 的初始投加浓度为协变量，以24 h 或48 h 内受试生物的累计死亡率为响应频率建立probit 回归模型，即可生成probit 回归模型下给定时间内TBC 对受试生物的毒性回归方程。根据方程，当致死率为50%时对应的TBC 浓度即为给定时间的半抑制浓度（LC50）。

（2）安全投加浓度（SC）

安全投加浓度(SC)为不影响水体生态环境下水体可接受的化学药剂投加浓度，计算公式为：

式中：LC5024h为24 h半抑制质量浓度，mg/L；LC5048h为48 h 半抑制质量浓度，mg/L。

（3）细胞活力抑制率（IR）及用效用—安全比（RES）

以藻细胞叶绿素浓度的降低来表示细胞受抑制的程度，抑制率（IR）公式如下：

式中：N0为对照组叶绿素质量浓度，μg/L；NS为试验组藻类叶绿素质量浓度，μg/L。

研究人员通过效用—安全比（RES）来衡量抑藻剂的应用价值[5]，公式如下：

式中：Ec为TBC 有效 抑藻质 量浓度，mg/L；IR48h为48 h 细胞活力抑制率，%。

RES数值越小，说明抑藻效果与生态安全性更好。当RES大于1 时，说明抑藻剂的有效抑藻浓度超过对水体的安全投加浓度，不适合被广泛应用；当RES数值小于1 时，说明抑藻剂的有效抑藻浓度在水体的安全投加浓度范围内，可应用于控制水体中的藻类。

2 结果与讨论

2.1 TBC 对3 种典型自然水体的抑藻效果

（1）投加不同浓度TBC 对3 种典型自然水体中蓝藻生长的影响

向3 种典型自然水体水样中投加不同浓度TBC 后发现，3 批重复试验趋势基本相同，水体中蓝藻叶绿素浓度（采用平均值）的变化见图1。

图1 投加不同浓度TBC 后蓝藻叶绿素浓度变化

由图1 可以看出，在无蓝藻的华工湖原水中，投加不同浓度TBC 后蓝藻叶绿素浓度在15 d 的培养期间一直为0。在含有蓝藻的中心湖与广工湖原水中，15 d 后蓝藻的叶绿素浓度与TBC 的投加量呈负相关，说明TBC 对蓝藻细胞的生长存在抑制作用，且浓度越高，抑制能力越强。当TBC 的投加质量浓度小于0.1 mg/L 时，TBC 对蓝藻的抑制能力较弱，中心湖及广工湖水体中的蓝藻叶绿素浓度在15 d 内仍处于增加状态，当TBC 的投加质量浓度大于0.5 mg/L 时，蓝藻的叶绿素浓度不断下降，肉眼可见水体短时间内绿色变浅、浊度降低且藻密度在15 d 内未出现反弹，说明TBC 抑制能力较强。有研究发现，许多化感物质均存在浓度效应，如李楠[6]研究了广玉兰、龙爪槐和黄杨浸提液对Microcystis aeruginosa 生长的影响，发现3 种植物的浸提液对Microcystis aeruginosa 的生长具有明显的抑制作用，且抑制作用随浓度的升高而增强。

不同自然水体中的蓝藻对TBC 的敏感性不同。在蓝藻占比为58.23% ～90.24%的中心湖水体中，当TBC 投加质量浓度为0.5 mg/L 时，水体中蓝藻受到强烈抑制，10 d 后抑制率达到80%，当TBC 投加质量浓度增至1 ～5 mg/L 时，蓝藻叶绿素变化情况与0.5 mg/L 时基本相同，说明中心湖中TBC 投加质量浓度为0.5 mg/L 时即达到饱和抑制浓度。在蓝藻占比为18.31 % ～19.65 %的广工湖水体中，抑制效果随TBC 投加浓度的增加不断增强，当TBC 投加质量浓度大于2.0 mg/L 时才基本达到饱和。说明中心湖水体中蓝藻比广工湖水体中蓝藻对TBC 更敏感，推测蓝藻在水体中占比越高，TBC 的抑制能力越强。

（2）TBC 不同初始投加浓度对3 种典型自然水体中绿藻生长的影响

向3 种典型自然水体水样中投加不同浓度TBC 后，3 批重复试验趋势基本相同，水体中绿藻叶绿素浓度（采用平均值）的变化见图2。由图2可以看出，当不含蓝藻的华工湖水体中投加不同浓度TBC 后，水体中绿藻浓度随时间变化情况与空白组基本相同，均随时间的增加而上升，绿藻叶绿素质量浓度均由400 μg/L 升至约550 μg/L，表明TBC 对绿藻没有抑制作用。在有蓝藻的中心湖及广工湖水体中，当TBC 投加质量浓度小于0.1 mg/L 时，绿藻浓度均逐渐降低并在第4 天趋于0。当TBC 投加质量浓度大于0.5 mg/L 时，15 d 后绿藻的叶绿素浓度基本与TBC 投加量呈负相关。即绿藻的叶绿素浓度随着TBC 投加浓度的升高反而降低。以上说明TBC 对藻类的抑制具有选择性，对蓝藻有显著的抑制作用，而对绿藻几乎没有抑制作用。有研究发现，许多化感物质均具有选择性，如李锋民等[7]对从芦苇分泌的化感物质2-甲基乙酰乙酸乙酯进行研究，发现其对于铜绿微囊藻和蛋白核小球藻的抑制作用较强，而对小球藻却几乎没有抑制作用。MANDAL S M 等[8]研究表明，沉水植物轮藻对羊角月牙藻和小球藻具有化感抑制作用，而对斜生栅藻的生长几乎没有影响。化感物质选择抑制性与化感物质的抑藻机理有关。TBC 是一种含有含有酚羟基和羧基的典型的酚酸类物质，酚羟基及醇羟基可通过氢键与藻类酶中的肽基结合从而使藻类酶的结构功能破坏[9]。由于不同藻类酶的结构不同，化感物质对酶的作用效果不同从而使得化感物质的抑制效果不同。同时，蓝绿藻细胞膜的结构不同也可能是造成这种差异另一的原因，如QIU X 等[10]研究发现，酚酸类物质可以改变藻细胞膜的通透性使细胞发生质壁分离，从而破坏藻细胞结构导致藻细胞死亡。

图2 投加不同浓度TBC 后绿藻叶绿素浓度的变化

结合蓝藻试验数据发现，TBC 投加质量浓度为0 或低于0.1 mg/L 时，中心湖与广工湖水体中蓝藻浓度不断上升，绿藻浓度不断下降，蓝藻为优势藻。而当TBC 投加质量浓度超过0.5 mg/L 时，则抑制了蓝藻的生长，从而使绿藻在与蓝藻的竞争中取得了优势，绿藻浓度不断增加。在自然环境下，化感作用是藻类的一种自我保护机制，可以帮助特定的种群在资源竞争中取得优势。如赤潮异弯藻通过细胞接触抑制血红哈卡藻的生长[11]，布氏常丝藻通过释放次生代谢物抑制铜绿微囊藻生长[12]。拟柱胞藻、铜绿微囊藻可释放毒素从而抑制其他藻类生长[13]。一般认为，硅藻与绿藻为有益藻类，在水产养殖行业有重要的应用价值，如绿藻属的蛋白核小球藻、硅藻属的小环藻是鱼虾蟹的优质饵料；卵囊藻、栅藻等复合绿藻可以降低鱼虾蟹的应激，减少发病率[14]；而蓝藻为有害藻，可产生危害人体的肝毒素及神经毒素等，并具有致癌效应[15]。因TBC 在抑制有害藻蓝藻的同时不对其他藻类产生影响，故具有良好的应用前景。

2.2 TBC 的毒性研究

（1）TBC 对大型溞的急性毒性研究

将蒸馏水及3 种自然水体中TBC 质量浓度分别设置为0 ，0.5 ，1.0 ，2.0 ，3.0 及5.0 mg/L，3批重复组中各水体内大型溞在96 h 内的累计死亡趋势基本相同，累计致死率变化见图3。由图3可以看出，大型溞的死亡率与TBC 浓度及暴露时间呈正相关，随着TBC 浓度的增加，相同时间内大型溞的死亡率不断增加，同浓度下暴露时间越长，大型溞的死亡率越高，且TBC 在自然水体中的致死率低于蒸馏水中。TBC 在最佳抑藻质量浓度为0.5 mg/L 时，各水体中TBC 致死率均处于较低水平，24 h 后致死率均为0，48 h 后在蒸馏水中致死率为10%，在自然水体中为0，96 h 后，水样中致死率均为20%。在TBC 最大投加质量浓度为5 mg/L 时，24 h 后自然水体中大型溞的致死率均为50%左右，蒸馏水中致死率为70%，48 h 后自然水体中大型溞的致死率均为60% ～65%，蒸馏水中致死率为80%；72 ～96 h 后所有水样中致死率均达到90%～100%。

图3 在蒸馏水及3 种自然水体中TBC 对大型溞的致死率影响

将致死率数据根据1.4.1 中的方法，采用SPSS 建立probit 回归模型，拟合毒性回归方程，计算半致死浓度（LC50），结果见表3。

表3 不同水体中TBC 对大型溞的毒性对比

由表3 可以看出，毒性方程拟合程度良好（R2＞0.8）。蒸馏水中24 h 和48 h 的LC50 分别为2.93 和2.50 mg/L，中心湖中分别为3.71 和3.35 mg/L，华工湖中分别为3.43 和2.93 mg/L，广工湖中分别为3.62和3.10 mg/L，将结果代入公式计算出蒸馏水、中心湖、华工湖、广工湖的安全质量浓度分别为0.54，0.82，0.68 和0.64 mg/L。发现所有水体中TBC 对大型溞的SC均大于中心湖水体中TBC 对蓝藻的EC（0.5 mg/L），证明TBC 在以蓝藻为优势藻的自然水体抑藻过程中对其他水生生物相对安全。

同时看出，TBC 在不同的水体环境中对大型溞的毒性程度不同。大型溞在不同的自然水体中对TBC 的耐受程度由强到弱为：中心湖＞广工湖＞华工湖＞蒸馏水。大型溞在自然水体中对TBC的耐受性比在蒸馏水中高，究其原因：①自然水体中的酚类物质可被水体中沉积物吸附，这一过程可有效降低酚类在水体中的扩散能力及毒性；②自然水体中的真菌和细菌均有以酚类物质为食的物种，从而推动水体中酚类物质的降解[16]。

TBC 在中心湖水体中对蓝藻的EC为0.5 mg/L，且该浓度下对大型溞的LC5048h为3.35 mg/L，根据安全效应比公式，TBC 对大型溞的RES数值为0.313 4，小于1，说明TBC 在其起效的蓝藻抑制浓度内，具有很好的生态安全性，不会对水生态环境造成明显危害。

（2）TBC 的降解产物研究

TBC 对人体眼睛、皮肤、粘膜和上呼吸道有刺激作用，可引起呼吸道和皮肤的过敏反应，除TBC本身外，TBC 在水体中的降解产物也影响水体的生态安全性。采用甲苯萃取后，通过超高分辨四极杆组合静电场轨道阱液质联用仪按照1.3.2 的条件对降解产物进行检测，结果显示，TBC 在蒸馏水中的降解产物包括对叔丁基邻苯二醌、邻苯二甲酸酐及邻苯二甲酸二丁酯和一些开环化合物如丁烯、异丁烯、叔丁醇、碳酸等。TBC 在自然水体中降解产物除对叔丁基邻苯二醌未检出外，其余降解产物与蒸馏水中的降解产物类型相同。

TBC 在水体中的降解过程主要由水体中自由基的作用而产生[17]。结合文献对试验结果进行研究：测得的降解产物中，TBC 在蒸馏水中生成对叔丁基邻苯二醌转化途径较为明确，李早英等[18]研究发现对叔丁基邻苯二酚经环境中氧化剂氧化可形成对叔丁基邻苯二醌。在3 种水体中均检测到丁烯、异丁烯、碳酸、草酸等开环化合物，根据上述理论可推测是由于自然水体中的羟基自由基、超氧阴离子自由基等对TBC 及其他氧化产物的化学键发生作用，使其在水体中的化学结构发生重整导致苯环开环，生成了丁烯、异丁烯、碳酸、草酸等开环化合物，其中丁烯进行二聚并生成邻二甲苯[19]，邻二甲苯被氧化后生成邻苯二甲酸酐[20]，氧化物继续氧化后生成邻苯二甲酸二丁酯[21]。大部分小分子开环化合物在自由基的作用下可进一步降解，从而降低TBC 及其降解产物对水体生态系统的毒性。

3 结论

（1）在自然水体中，TBC 对蓝藻表现出良好的抑制效果，抑制能力随投加浓度的升高而增强，自然水体中蓝藻占比越高,TBC 的抑藻效果越好。在以蓝藻为优势藻的中心湖水体中，当TBC 投加质量浓度为0.5 mg/L 时达到饱和抑制浓度，在蓝、绿藻优势均等的广工湖水体中，TBC 投加质量浓度为2 mg/L 时达到饱和抑制浓度。且抑制效果持续时间长，在15 d 内未反弹。

（2）TBC 对藻类的抑制具有选择性，对有害蓝藻有显著的抑制作用，而对有益绿藻几乎没有抑制作用。在蓝绿藻的竞争中，TBC 对有害蓝藻的抑制效果可使有益绿藻获得竞争优势，从而使水体中藻类群落发生演替。

（3）TBC 在所有水体中对大型溞的安全投加质量浓度均大于在中心湖水体中对蓝藻的EC（0.5 mg/L），且TBC 在自然水体中对大型溞的生物毒性低于蒸馏水中。RES值为0.31，属于安全性较好的抑藻材料，可应用于处理水体中的藻类爆发而不会对水域生态系统产生明显影响。

（4）TBC 在水体中的降解产物主要包括TBC 的氧化产物对叔丁基邻苯二醌、邻苯二甲酸酐及其氧化物邻苯二甲酸二丁酯和和一些开环化合物如丁烯、异丁烯、叔丁醇、碳酸等，降解产物无明显生态安全隐患。