培元抗癌汤通过调节癌相关成纤维细胞抑制H22肝癌细胞增殖及诱导凋亡的实验研究*

司海龙 张 洁 马一鸣 马仰仰 肖海娟 方 瑜 王惠玲

陕西中医药大学附属医院 (陕西 咸阳， 712000)

中医药治疗恶性肿瘤由来已久，临床疗效肯定，既能增强现代医学治疗效果、缓解治疗过程中的副反应，又能明显改善患者生存质量、延长生存期。近来大量的研究又证明中医药能通过干预肿瘤微环境(TME)抑制恶性肿瘤的生长和转移。陕西省名中医、中医肿瘤内科名家李仁廷教授依据多年临床经验组方培元抗癌汤，前期的研究证实该方在动物实验上能够抑制H22肝癌细胞，下调端粒酶水平[1]；在临床实验方面培元抗癌汤联合 FOLFOX4化疗方案对于中晚期肝癌患者疗效明确[2]。本研究是在前期的研究基础之上，观察中药培元抗癌汤对肝癌微环境中癌相关成纤维细胞(CAFs)调节作用，进而对H22肝癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物和细胞株 H22肝癌细胞株(陕西中医药大学实验中心提供)；CAFs原代细胞分离、培养并鉴定；雄性昆明小鼠购自西安交通大学医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(陕 2017-003)。

1.1.2 药物及试剂 培元抗癌汤药物组成：西洋参、黄芪、炒白术、莪术、白花蛇舌草、茯苓各15 g，郁金、厚朴、法半夏、焦山楂各12 g，购于陕西中医药大学附属医院，经过醇沉[3]提取，配制成培养抗癌提取物PYAC(200 mg/ml)；浓缩型正常山羊血清(封闭)、荧光(Cy3)标记羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；Triton X-100、DAPI购自碧云天公司；α-SMA购自Abcam公司；Vimentin购自武汉三鹰生物技术有限公司；Mouse GRO α/CXCL1 ELISA Kit、Mouse GROβ/CXCL2 ELISA Kit购自Elabscience公司；HiScript Reverse Transcriptase(RNase H)购自VAZYME公司，SYBR Green Master Mix购自VAZYME公司；引物由天一辉远公司合成；GAPDH兔多抗购自杭州贤至生物有限公司；基质金属蛋白酶(MMP-2)兔多抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；MMP-9鼠单抗购自Abcam公司；HRP标记羊抗小鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；CCK8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自MCE公司；细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物。

1.2 实验仪器 生物显微镜(奥林巴斯，BX53型)全自动酶标仪(Multiskan MK3，Thermo scientific)；实时荧光定量PCR仪(ABI，QuantStudio 6)；微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)；Aquapro超级纯水仪(艾科浦，AJY-0501)；PCR仪(东胜创新生物科技有限公司，EDC-810)；垂直电泳槽(北京六一仪器厂，DYCZ-24DN)；电转仪(北京六一仪器厂，DYCZ-40)；流式细胞仪(Beckmancoulter，cytoFLEX)；水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，TS-1)。

1.3 实验方法

1.3.1 H22荷瘤小鼠模型制备 在无菌环境下，将鼠源性肝癌细胞株H22注入BALB/c小鼠腹腔内,荷瘤小鼠腹水异常增加时,处死小鼠并小心无菌收集腹水，用0.9%氯化钠洗3次，再用0.9%氯化钠溶液调整为1×106/ml浓度癌细胞悬液,通过台盼蓝染色证实H22细胞存活率>95%，5只健康小鼠腋下接种瘤细胞悬液进行造模，腋下有瘤体为造模成功。

1.3.2 小鼠CAFs细胞的分离培养 无菌条件下分离肿瘤组织，在与正常组织交界处浆膜面尽量多取包括上皮组织及其结缔组织质软组织，无菌 PBS液洗净；去除多余的上皮、肿瘤、脂肪组织后，将结缔组织剪碎放入培养瓶中，加入胶原酶在培养箱内消化，镜下观察出现大量细胞时终止消化；将单细胞悬液注入培养瓶中，加入培养基后置 37℃、5% CO2培养箱中培养，消化法进行细胞传代；用第三代传代细胞做CAFs鉴定。

1.3.3 CAFs鉴定 复苏CAFs细胞并消化传代，调整CAFs细胞浓度1.0×105/ml，每孔400 μl注入24孔板，孔底铺有细胞爬片，收集细胞爬片进行免疫荧光标记，检测Vimentin、α-SMA表达，双阳性表达的细胞可鉴定为CAFs。在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min； 0.5% Triton X-100室温通透20 min；PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗、并放入湿盒，4℃孵育过夜；加荧光二抗：PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中室温孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min；加荧光二抗后，所有操作步骤在较暗处进行。复染核：滴加DAPI避光孵育5 min染核，PBST浸洗4次、每次5 min；吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.3.4 CCK8法检测培元抗癌汤对H22细胞的增殖抑制作用 复苏CAFs细胞并消化传代，调整细胞浓度5.0×104/ml，每孔200 μl注入6孔板，每组设置3个复孔。分组：模型组、中药组，中药组细胞加入PYAC干预48 h后，换用无血清的新鲜DMEM培养基后继续培养24 h，收集培养上清，1 000 rpm离心10 min 以去除细胞及碎屑，保存备用。复苏、消化、传代H22细胞，取对数生长期、生长状态良好的H22细胞，以5×103个/孔，密度接种于96孔板，分别将模型组、中药组CAFs细胞上清加入对应组别的H22细胞，每孔20 μl，培养24 h。每孔加入10 μl CCK8试剂，37℃培养4 h；酶标仪测定各孔450 nm处吸光值。

1.3.5 流式细胞学检测培元抗癌汤对H22细胞的凋亡诱导作用 取处于对数生长期、生长状态良好的上述H22细胞，以2×105个/孔密度接种于6孔板，37℃培养过夜；分别将模型组、中药组CAFs细胞上清加入对应组别的H22细胞培养24 h。收集细胞，用PBS将细胞润洗2次，1 500 rpm离心5 min，按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行标记。加入500 μl Binding Buffer重悬细胞，加入5 μl AnnexinV-FITC混匀后加入5 μl PI混匀，室温避光反应5～15 min(同时设阴性对照，即正常细胞不加Annexin和PI；以凋亡效果最明显的溶剂组作为阳性对照1，只加5 μl AnnexinV；以凋亡效果最明显的溶剂组作为阳性对照2，只加5 μl PI)，流式细胞仪检测。

1.3.6 ELISA法检测CAFs细胞上清中CXCL1、CXCL2含量 复苏CAFs细胞并消化传代，分为模型组、中药组,每组3个复孔，药物干预方法同上。按试剂盒说明书分别检测细胞上清中CXCL1、CXCL2的含量。

1.3.7 PCR检测CAFs细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表达 复苏CAFs细胞并消化传代，调整细胞浓度5.0×104/ml，每孔200 μl注入6孔板，分为模型组、中药组，每组3个复孔。药物干预方法同上，48 h后吸掉培养上清，每孔加入1 ml 4℃预冷的PBS沿着细胞板壁缓慢加入，平放轻轻摇动，然后弃去洗液。重复以上操作2次，加入1 ml Trizol提取RNA并测定总RNA纯度和浓度，逆转录成cDNA，反应条件：25℃ 5 min，50℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 10 min。实时荧光定量PCR检测MMP-2、MMP-9 mRNA表达，反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40个循环。绘制溶解曲线，最终数据以2-ΔΔCt进行分析。

表1 引物序列表

1.3.8 Western Blot检测CAFs细胞中MMP-2、MMP-9蛋白质表达 复苏CAFs细胞并消化传代，调整细胞浓度5.0×104个/ml，200 μl/注入6孔板，分为模型组、中药组，每组3个复孔。药物干预48 h后，吸掉培养上清，PBS洗3次以洗去培养液。每孔加入1 ml裂解液(含10 μl 100 mM PMSF)，用干净的刮棒将细胞刮于一侧，然后将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中，离心取上清测定蛋白浓度。蛋白变性后电泳转膜，封闭后加一抗、二抗，显色曝光，用BandScan软件分析胶片灰度值。

2 结果

2.1 CAFs鉴定结果 细胞爬片免疫荧光单标鉴定的结果显示Vimentin、α-SMA表达阳性，提示CAFs分离培养成功。见图1。

2.2 培元抗癌汤对H22细胞的增殖抑制作用 与模型组相比，中药组H22细胞的增殖被显著抑制，差异具有统计学意义(0.95±0.04vs0.99±0.02，P<0.05)。

2.3 培元抗癌汤诱导H22细胞的凋亡 与模型组，相比中药组H22细胞凋亡增加，差异具有统计学意义(4.08±0.53vs0.97±0.10，P<0.05)。见图2。

2.4 培元抗癌汤对CAFs细胞上清中CXCL1与CXCL2含量的影响 见表2。

表2 2组CAFs细胞上清CXCL1、CXCL2含量比较

2.5 培元抗癌汤地CAFs细胞MMP-2、MMP-9 mRNA表达的影响 见表3。

表3 2组CAFs细胞MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达量比较

2.6 培元抗癌汤对CAFs细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响 见表4，图3。

表4 2组CAFs细胞MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量比较

3 讨论

近年来恶性肿瘤的基础研究和临床治疗取得了长足的进步，大量的靶向药物、免疫治疗药物被开发出来应用于临床，患者的生存期和生活质量有了很大改善。这些新的药物和疗法的进步是基于对恶性肿瘤更深入的认识。传统的理论主要集中于肿瘤细胞这种“新生物”本身，研究的重点是筛选针对肿瘤细胞本身的治疗方式、药物，于是手术、放疗、化疗成了恶性肿瘤的主要治疗方式。但是这些方法已经遇到了瓶颈，临床疗效无法明显提高，手术范围不能再扩大，放疗剂量不能再增加，化疗周期不能再增加，局部介入疗效、适应症有限。新的理论研究不是只关注肿瘤本身，而且关注促进其生长、转移的细胞以及非细胞成分，这就是TME的概念[4-6]。现在认为TME是恶性肿瘤细胞发展的基础，这些细胞以及非细胞成分相当复杂且有独特的缺氧、高酸的理化环境[7]。实际上人类对TME中纷繁复杂成分及其相互作用关系认识有限，但仍是当前全世界研究的热点和前沿。目前文献研究较多的是：M1和M2巨噬细胞，CAFs，肿瘤干细胞(CSC)，髓源性抑制细胞(MDSC)，趋化因子(Chemokines)，整合素家族(Integrins)等[8,9]。

随着恶性肿瘤在我国发病率逐年的增高，使用中医药治疗的人数也越来越多，由于可靠、可见的临床疗效，受到患者普遍的欢迎。但直到目前为止，其干预恶性肿瘤机制，生物学、药理学实质仍不清楚，其科学内涵仍需要深入研究。中医学中并无恶性肿瘤的病名，结合其临床表现、病因病机应当属于中医学中“症瘕、积聚、岩、瘤、”等范畴。目前认为从中医学角度认为癌之成因责之于虚实两端，实多为痰凝、气滞、血瘀、热毒[10]，虚多为气血、精液、阴阳、脏腑的不足，如《外证汇编》指出“正气虚则成岩”。《医宗必读.积聚》：“初者，病邪初起，正气尚强，邪气尚浅，则任受攻；中者，受病渐久，邪气较深，正气较弱，任受且攻且补；末者，病魔经久，邪气侵凌，正气消残，则任受补。”指出恶性肿瘤的治疗重点在于扶正祛邪，也是治疗的大法。培元抗癌汤为李仁廷教授根据多年治疗恶性肿瘤临床经验所创制，该方既有扶正的西洋参、黄芪、炒白术、茯苓等药物，又有祛邪的莪术、白花蛇舌草、郁金、厚朴等药物，全方益气养阴、培补元气，理气活血、清热解毒，祛邪以抗肿瘤。

随着关于TME研究的积累，人类对于TME的认识不断深入，特别是TME与恶性肿瘤细胞之间关系。CAFs是TME最重要的细胞成分之一，或者说关键成分之一[11,12]。大量研究证明TME中蕴含有大量的CAFs，并能促进肿瘤细胞的生长、侵袭以及转移[13,14]。Huang等[15]研究证明在肝细胞癌中CAFs通过血管内皮生长因子调节的EZH2/VASH1信号通路促进肿瘤血管增生，并促进恶性肿瘤的发展。Ma等[16]利用荧光原位杂交(FISH)和qPCR评估了CAFs、肿瘤组织和非肿瘤细胞的端粒长度，提出CAFs中端粒缩短与生存率降低和复发率增加相关，被认为是HCC患者预后的独立预测因子。这些发现在肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库的371例肝细胞癌患者中得到了证实。Kubo等[17]总结了CAFs在肝细胞癌中免疫抑制、血管生成、治疗靶点和化疗耐药等方面的作用。本研究利用原代细胞分离培养技术分离出CAFs，并进行了鉴定，Vimentin、α-SMA表达阳性提示分离培养成功，进而采用CAFs培养上清干预H22细胞，体外模拟肿瘤微环境。

CAFs会释放大量的趋化因子，如CXCL1和CXCL2，趋化因子的主要作用是促进肿瘤细胞增生、侵袭和转移。Shi等[18]首次报道了CXCL1和CXCL2能促进骨髓细胞向MDSC分化，从而促进肿瘤细胞的生长和发展。Miyake等[19]研究发现，CXCL1单克隆抗体(HL2401)可以诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管化。本课题实验结果与以上文献结果一致，经过培元抗癌汤干预后，中药组CAFs细胞的CXCL1、 CXCL2表达较模型组明显下降(P<0.05)，提示中药培元抗癌汤可以抑制CAFs分泌CXCL1和CXCL2，进而抑制H22细胞增殖并诱导其凋亡。Song等[20]发现在肝细胞癌中减少miR-532-5p表达可以通过靶向CXCL2抑制肿瘤的生长和转移。CAFs还可通过诱导和产生MMP促进肿瘤生长和转移。Bourboulia等[21]总结分析了MMP的作用，指出MMP-2、MMP-9可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。结合本实验的结果，CAFs细胞中 MMP-2、MMP-9 mRNA表达和蛋白质表达一致，经过药物干预后中药组CAFs细胞MMP-2、MMP-9表达较模型组明显下降，进一步提示中药培元抗癌汤可以抑制CAFs分泌MMP-2、MMP-9，进而抑制H22细胞增殖并诱导其凋亡。本研究结果显示，培元抗癌汤干预可抑制H22细胞增殖、诱导H22细胞凋亡，原因可能是调节CAFs及其分泌的细胞因子MMP-2/MMP-9与CXCL1/CXCL2。

综上所述，培元抗癌汤可通过调节CAFs抑制其MMP-2/MMP-9与CXCL1/CXCL2表达，抑制肿瘤生长、发展，这一结论与本课题前期研究结果一致[22，23]。