唐草片对大鼠肝纤维化及NF-κB P65/IκBα信号通路的影响*

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠72只，雌雄各半，体质量(100～130)g，购于广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2013-0002，实验动物质量合格证号：No.44007200053321。

1.2 药品与试剂唐草片购自上海百岁行药业有限公司；秋水仙碱片购自西双版纳药业有限责任公司；Elisa试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；猪血清购于广州未来生物科技有限公司；α-SMA、NF-κB P65、IκBα和β-actin抗体均购自CST公司。

1.3 主要器械 RM2015型切片机购自德国徕卡有限公司；BK-DM500型数码生物显微镜购自重庆奥特光学显微镜有限公司；RT-6100型酶标仪购自Rayto；552BR144491迷你垂直电泳仪和153BR94063迷你电泳转印芯购自BIO-RAD；4200型化学发光成像仪购自Tanon公司。

1.4 动物分组、造模与给药 72只大鼠适应性喂养一周后，每组各12只，雌雄各半，按体重以随机区间分组法分组分为：正常组，模型组，秋水仙碱组(0.12 mg/kg)，唐草片组高剂量组(2 g/kg),唐草片中剂量组(1 g/kg)，唐草片低剂量组(0.5 g/kg)。模型的制备参考周波等[3]研究者的方法。造模开始第一天，除正常组外，各组均按5 ml/kg的比例皮下注射20%的CCl4花生油混合溶液。自此，每隔3 d按3 ml/kg比例进行皮下注射。造模后第2 d按照3 ml/kg比例进行猪血清腹腔注射，过后则间隔3天按照1 ml/kg比例进行一次腹腔注射。于造模第3周起，每周注射20%的CCl4花生油混合溶液及猪血清各一次。从第5周开始对各组灌胃干预，每天一次，每次2 ml，正常组与模型组灌胃同等容积纯净水。灌胃8周末，于灌胃结束后禁食24 h，称重，取1%戊巴比妥钠，按6 ml/kg剂量给予大鼠腹腔注射进行后续采集标本实验。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 标本收集及指标检测样品采集麻醉成功后，迅速解剖，剥离大鼠腹主动脉，采用一次性负压采血器采全血10 ml。将血液室温静置2 h后，以3 000 r/min速度离心10 min。吸取上清液，-80℃保存备用。剥离肝脏，取肝左上叶以4%甲醛液固定；其余肝组织放进液氮罐，以便后期检测。

1.5.2 HE染色取肝左上叶放入4%甲醛液固定48 h，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，常规切片5 m, HE染色。用显微镜观察HE染色的大鼠肝组织切片。

1.5.3 Masson染色取肝左上叶放入4%甲醛液固定，石蜡包埋，常规切片5 m, Masson染色。胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。

1.5.4 免疫组化染色法检测肝组织α-SMA含量蜡块切片后进行免疫组化染色，检测肝组织α-SMA蛋白的表达情况，该蛋白免疫组化染色的阳性反应产物为胞浆出现棕黄色细颗粒状物。

1.5.5 血清肝功能指标、血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C及肝脏TNF-α、IL-6的检测 AST、ALT测定均采用全自动生化仪检测。ELISA法检测血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C及肝脏TNF-α、IL-6水平，肝脏以生理盐水按1∶10进行匀浆，3 000 r/min离心15 min，分取上清于-80℃低温冰箱保存，按照试剂盒要求采用酶标仪于450 nm处测定吸光度(A)值。

1.5.6 WB检测肝组织NF-κB P65、IκBα蛋白的表达 20 mg肝组织加入裂解液充分裂解后收集上清，BCA法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度每个凝胶孔加入30 μg的已变性的蛋白样品后进行电泳分离、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育后在Tanon 4200化学发光成像系统里成像。

2 结果

2.1 唐草片对大鼠病理结果的影响 HE染色显示：正常组大鼠肝小叶中央静脉周围肝细胞排列成板层状，肝板细胞排列规则整齐，肝细胞未见肿胀或坏死性改变，小叶结构完整，未形成假小叶，也未见纤维增生。模型组肝细胞发生明显的脂肪变性且充满了大的脂肪空泡，细胞核被挤压至一侧，肝板结构排列紊乱，小叶周围部分肝细胞发生坏死。经治疗后，各组染色可见肝细胞脂肪变性、肝细胞中脂肪小滴、纤维组织增生等表现均较模型组有所改善。见图1。

Masson染色显示：正常组大鼠肝组织肝索排列整齐，呈条索状向四周放射状排列，小叶结构清晰，仅在汇管区见少量胶原纤维；模型组大鼠肝细胞排列紊乱，汇管区和中央静脉之间胶原纤维明显增多，形成纤维纵膈，交结形成完全或不完全假小叶，同时可见细胞变性、坏死；秋水仙碱、唐草片高、中剂量组大鼠未见明显胶原纤维沉积，唐草片低剂量组可见少部分胶原纤维沉积。见图2。

2.2 唐草片对肝纤维化大鼠肝组织α-SMA蛋白表达的影响正常组大鼠仅在汇管区周围有微量表达，而模型组大鼠在汇管区和中央静脉之间汇集大量 α-SMA，秋水仙碱组大鼠和唐草片各剂量组大鼠较模型组大鼠而言α-SMA表达明显减弱。见图3。

2.3 唐草片对肝纤维化大鼠肝功能的影响见表1。

表1 唐草片对肝纤维化大鼠肝功能影响比较

2.4 唐草片对肝纤维化大鼠血清肝纤四项水平的影响见表2。

表2 唐草片对肝纤维化大鼠血清肝纤四项水平影响比较

与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.5 唐草片对肝纤维化大鼠肝脏细胞因子水平的影响见表3。

表3 唐草片对肝纤维化大鼠肝脏细胞因子水平的影响比较

2.6 唐草片对肝组织NF-κB P65/IκBα蛋白水平的影响见图4，表4。

表4 唐草片对肝纤维化大鼠肝组织NF-κB P65，IκBα蛋白表达量的影响比较

3 讨论

肝纤维化是肝脏对各类原因所致肝损伤的一种创伤愈合反应，中医将肝纤维化归属于胁痛、黄疸、臌胀等范畴。中医认为大部分疾病的发生具有“初病在经，久病入络”的特点，由于肝纤维化的形成及发展过程较漫长，因此大多具有久病多虚，易致瘀的特点[3]。唐草片组方意在“清热解毒，活血益气”。该方君药为老鹳草，性味辛苦平，归肝肾脾经，臣为金银花，性味甘寒，寒可清热解毒，甘善补虚养血；柴胡苦、微寒，善疏肝，升阳；黄芪，性甘微温，具补中益气，扶正驱邪之效；佐以瓜蒌润肺化痰，利气宽胸，红花、银杏叶、全蝎、鸡血藤皆有活血化瘀，祛瘀生新之功效。甘草为使，解毒、调和诸药。诸药配伍攻补兼施，相辅相成。现代药理研究发现老鹳草主要化学成分包括鞣质、黄酮类、有机酸和挥发油等[4]，其中老鹳草分离出的老鹳草素、熊果酸、齐墩果酸是已知的具有保护肝细胞作用的单体。研究表明，老鹤草素具有抑制肝脏线粒体、微粒体脂质过氧化以及缓解CCl4所致肝损伤的作用[5，6]。熊果酸对酒精所致肝损伤有保护作用，其机制与减轻脂质过氧化，抑制氧化应激反应以及炎症因子的过量释放有关[7]，同时通过抑制相互作用的NOX4/ROS和RhoA/ROCK1信号通路逆转肝纤维化[8]。

核转录因子NF-κB被认为在调控组织损伤、炎症产物编码基因的表达和免疫反应中起重要作用，在经典的信号通路中，NF-κB/Rel蛋白与IκB蛋白结合并受其抑制，NF-κB的激活主要是由多种细胞外刺激信号引起，如促炎细胞因子TNF-α、IL-6、细菌脂多糖等，活化的NF-κB转移至细胞核内，诱导相关靶基因的转录，调节细胞功能从而促进肝细胞的再生，减轻肝脏炎症、抑制纤维的增生[9-11]。

本实验结果提示唐草片对四氯化碳联合猪血清诱导的肝纤维化大鼠具有保护作用，能够显著减轻肝纤维化大鼠的肝细胞损伤，促进ALT、 AST 活性明显下降，能够降低TNF-α、IL-6从而减轻肝组织的炎症反应，使肝组织病理明显改善，其机制可能与抑制NF-κB P65蛋白的表达，促进IκBα的表达，调节NF-ΚB P65/IκBα的表达有关。