基于网络药理学及分子对接探讨清热活血方对心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制

纪树亮，李 睿，孙治中，林莉雯，纪晓栋，吴 伟

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是指心肌梗死(myocardial infarction，MI)病人行经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)等再灌注治疗后，心肌损伤进一步加重的现象。MIRI往往与炎症反应、钙超载、内质网应激、自噬、凋亡等有关[1-2]，但具体机制尚未明确。MIRI可引发恶性心律失常、心力衰竭等严重不良后果。因此，积极预防和缓解PCI术后并发的MIRI是提高心肌缺血救治效率及急性心肌梗死病人远期预后的关键。近年来，中医药在治疗疾病方面已表现出明显优势。清热活血汤具有清热解毒活血的功效。前期研究发现，清热活血方可有效减少PCI术后病人MIRI发生及发挥保护心肌的作用[3]，但其潜在治疗机制尚不清楚。本研究基于网络药理学及分子对接预测清热活血方对MIRI的保护作用机制，以期为后期实验研究提供理论支撑与参考。

1 资料与方法

1.1 清热活血方活性成分的搜集及靶点预测 使用“Dan Shen”“Chi Shao”“Chuan Xiong”“Hong Hua”“Jiang Xiang”“Mao Dong Qing”“Haung Qin”作为清热活血方中7味中药的检索式，在BAT-MAN(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)网站的重要数据库中检索每一味中药对应的活性成分。使用BAT-MAN网站内置的分子匹配系统进行活性成分的靶点预测，根据匹配分值选取得分>20分的靶点作为预测靶点。

1.2 搜集MIRI靶点并与清热活血方靶点取交集 使用“myocardial ischemia reperfusion injury”作为MIRI的检索式，在GeneCards(https：//www.genecards.org/)疾病靶点数据库中检索获取与MIRI相关靶点。将疾病靶点与清热活血方的预测靶点取交集，获取的靶点即为清热活血方治疗MIRI的相关靶点。结果使用Omicshare(http：//www.omicshare.com/tools/)云平台制作韦恩图。

1.3 构建清热活血方治疗MIRI的“成分-靶点”图 依据清热活血方治疗MIRI的相关靶点，找出对应的活性成分，使用Cytoscape 3.5.3构建清热活血方治疗MIRI的成分-靶点网络，并使用网络分析模块对网络进行拓扑参数分析，按照连接度(degree)的大小对图像由大到小排列，得到“成分-靶点”图。

1.4 构建“蛋白-蛋白”相互作用(PPI)网络并提取核心靶点 将清热活血方治疗MIRI的相关靶点导入STRING(https：//string-db.org)数据库，设定物种为人，对靶点进行分析，得到靶点的“蛋白-蛋白”作用关系图。并将对应关系保存，导入Cytoscape 3.5.3软件构建靶点之间的PPI图，使用内置的网络分析模块进行拓扑参数分析，选取degree值大于二倍中位数的靶点，作为清热活血方治疗MIRI的核心靶点。

1.5 富集分析 将核心靶点导入DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)数据库，通过功能分析模块进行基因本体(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析。GO分析包括3个类别：细胞组分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)，3组中选取具有统计学意义(P<0.05)的通路，并且排除细胞内基础代谢相关通路，整理后通过Omicshare云平台的GO富集分析模块可视化。KEGG结果选择具有统计学意义(P<0.05)的通路，排除寄生虫及癌症等不相关通路，通过Omicshare云平台的富集分析高级气泡功能构建KEGG分析的高级气泡图。

1.6 分子对接 选取核心靶点以及活性成分中degree值较为靠前的部分靶点及活性成分进行分子对接。在PDB(https：//www.rcsb.org)数据库中找出靶点蛋白3D结构，使用Auto Dock Vina软件将靶点蛋白和活性成分进行分子对接，认为结合能<-20.9 kJ/mol，提示结合有意义，即活性成分与核心靶点间的作用关系具有一定的可靠性。

2 结 果

2.1 清热活血方各药物活性成分及药物作用靶点 通过检索筛选及匹配后，获得各药物活性成分及药物作用靶点分别为：丹参活性成分38个、药物作用靶点1 806个，红花活性成分20个、靶点771个，赤芍活性成分3个、药物作用靶点42个，川芎活性成分70个、药物作用靶点4 268个，降香活性成分3个、药物作用靶点24个，毛冬青活性成分2个、药物作用靶点12个，黄芩活性成分13个、药物作用靶点652个，将各药物活性成分及药物作用靶点合并查重后，共获得药物活性成分149个，药物作用靶点1 241个。

2.2 MIRI疾病相关靶点和“清热活血方-MIRI”共同作用靶点预测 通过检索GeneCards数据库，共获得MIRI相关靶点1 753个，与清热活血方药物作用靶点取交集，得到“药物-疾病”共同作用靶点223个。详见图1。

图1 清热活血方-MIRI共同作用靶点韦恩图

2.3 清热活血方治疗MIRI的“药物活性成分-共同作用靶点”网络图 通过“清热活血方-MIRI”共同作用靶点能够反向推出相对应的药物活性成分，223个共同作用靶点分别对应114个药物活性成分，并将二者的对应关系导入到Cytoscpe 3.5.3软件中，将“药物活性成分-共同作用靶点”可视化，绘制网络图，并使用内置的网络分析功能对网络的拓扑参数进行分析，依据degree值，调节点的大小、位置，degree值越大，点越大，说明这个药物活性成分或者靶点在清热活血方治疗MIRI方面具有更重要的潜在作用，但还应结合相关实验研究进行判断和讨论。由网络图(见图2)可知，主要的药物活性成分包括隐丹参酮、棕榈酸、大黄酚等。degree值前20位的活性成分详见表1。

图2 清热活血方治疗MIRI的“药物活性成分-共同作用靶点”网络图

表1 degree值前20的活性成分

2.4 PPI关系及核心靶点筛选 将223个共同作用靶点全部导入STRING数据库，得到“蛋白-蛋白”相互作用关系。再将数据导入Cytoscape 3.5.3进行可视化，并计算网络拓扑参数，设定大于Degree值的2倍中位数作为核心靶点筛选条件，共获得核心靶点77个。各核心靶点间相互作用关系详见图3。

图3 核心靶点间相互作用关系图

2.5 核心靶点的GO富集分析 对核心靶点进行GO富集分析，共获得332个条目，其中BP 130条、CC 73条、MF 129条。依据富集基因数目进行排序，选取前20条目进行展示，并排除细胞内无特异性代谢相关通路，其中BP有7条，主要涉及细胞的增殖与凋亡、相关细胞因子的分泌调控以及钙离子的转运等；CC有7条，主要涉及膜筏、线粒体膜、内质网等部位；MF有6条，主要包括受体配体结合以及细胞因子活性等。详见图4、表2。

表2 GO富集结果

图4 GO富集圈图

2.6 核心靶点的KEGG通路富集分析 对核心靶点进行KEGG富集分析，根据富集基因数目进行排序，筛选获得9条通路，主要涉及肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路、核因子-κB(NF-κB)信号通路、Janus激酶-信号转导与转录激活子(JAK-STAT)信号通路、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路等。详见图5。

图5 KEGG通路富集分析气泡图

2.7 分子对接 根据核心靶点及通路富集分析结果，清热活血方治疗MIRI主要涉及炎症、自噬与凋亡等方面。TNF、白细胞介素(IL)-6是促炎性因子，TP53与凋亡相关，均在MIRI病理过程中有重要的调控作用[4]；胰岛素样生长因子1(IGF-1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)介导的自噬参与了心脏疾病的发展过程，能够调控缺血心肌的自噬水平[5]。故选取上述靶点与degree值前10的药物活性成分进行分子对接，验证二者的结合能力(见图6)。分析结果可知，除caffeic acid dimethyl ether、linoleic acid、myrcene外，其余药物活性成分与靶点蛋白的结合能均<-20.9 kJ/mol，说明结合情况良好(见图7)。

图6 分子对接结合能热图

图7 结合能最低的两个分子对接图

3 讨 论

一般认为，MIRI的病机多为血瘀[6]。陈可冀院士在血瘀病机基础上提出“瘀毒致变”学说[7]。吴伟教授结合岭南地区气候湿热、土卑地薄，人们嗜食肥甘厚味或精神压力大、劳神耗气，伤及心脾、滋生火热，进而提出热毒血瘀乃胸痹心痛(冠心病)病人重要病机，并创立了清热活血方[3]。清热活血方由毛冬青、黄芩、川芎、赤芍、降香、红花和丹参组成。前期临床研究发现，清热活血方能有效提高急性ST段抬高型心肌梗死PCI术后病人的临床疗效及降低病人死亡率[8]。有研究指出，与单用活血中药治疗相比，将活血化瘀中药与清热解毒中药结合组方进行治疗可进一步提高临床疗效[9]。有关药理学研究表明，活血化瘀方药，如冠心Ⅱ号方[10]，可改善心脏微循环。清热解毒中药具有抗炎、降低血脂等作用[11-12]。在活血化瘀基础上，联合清热解毒中药，可进一步降低血脂水平，减少炎性细胞浸润及斑块形成，有效防治动脉粥样硬化[13-14]。然而，目前清热活血方治疗MIRI的潜在药理机制的报道较少，清热联合活血中药的药理效应仍有待进一步研究证实。

本研究通过网络药理学及分子对接技术对清热活血方的治疗机制进行了初步预测，结果显示，清热活血方主要的活性成分包括隐丹参酮、棕榈酸、大黄酚等。研究显示，隐丹参酮能够抑制TNF-α诱导的黏附因子表达，减轻血管内皮细胞损伤，改善MIRI[15]。通过降低棕榈酸浓度，有助于MIRI后大鼠心功能的恢复[16]。大黄酚能够降低小鼠脑缺血再灌注后多器官的氧化应激水平，抑制心脏等多个脏器的细胞凋亡[17]。此外，结合有关文献，黄芩有效成分黄芩苷可通过抗炎、抑制内质网应激等作用改善MIRI[18]；毛冬青皂苷E可减轻心肌氧化应激水平，抑制细胞凋亡率，发挥心肌保护作用[19]。基于以上研究，推测清热活血方主要是通过抗炎、抗氧化应激、抑制心肌细胞凋亡等作用发挥保护MIRI的作用。

分析并结合目前相关研究得到主要靶点为：IL-6、TNF、TP53、HIF-1α、IGF-1等。通路富集分析推测，清热活血方可能涉及参与细胞凋亡、炎症反应等生物学过程，通过调控TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等发挥治疗作用。TNF信号通路可通过不同途径来激活体内炎症反应、诱导细胞凋亡等。有实验研究指出，通过减少IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌，能够减小心肌梗死面积、改善MIRI[20-21]。通过使用TP53抑制剂负调控TP53诱导的细胞凋亡途径，减少MIRI风险区域，提高心脏功能[22]。PI3K/Akt是调控细胞自噬的主要信号通路之一，心肌细胞发生缺血缺氧的早期阶段PI3K/Akt信号通路被激活，进而抑制其下游雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性，促进自噬，降解细胞内多余蛋白质及衰老的细胞器，维持细胞内环境稳态，保护机体细胞[23]。当缺血发生时，HIF-1α水平在胞内迅速升高，从而诱导自噬，改善心肌损伤[5]。此外，IGF-1也能够通过促进自噬，减轻大鼠心肌细胞凋亡[24]。MAPK信号通路同样参与了MIRI的调节，主要包括细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-Jun-氨基端激酶1/2(JNK1/2)和p38 MAPKα/β 3条并行信号通路。有研究发现通过抑制p38 MAPK磷酸化，上调抗凋亡基因Bcl-2的表达以及下调促凋亡基因BAX等的活性，可减少心肌细胞凋亡，提高再灌注时心脏功能[25]。提示清热活血方可能通过调控自噬、抑制心肌细胞凋亡，改善MIRI。此外，本研究分子对接结果提示清热活血方部分活性成分与MIRI疾病相关靶点具有较好的结合活性，一定程度上印证了本研究预测的清热活血方活性成分与MIRI疾病相关靶点间的作用关系。

综上所述，本研究从网络药理学方法及分子对接角度，预测并探讨了清热活血方治疗MIRI的潜在分子作用机制，揭示了清热活血方具有多成分、多靶点、多通路的综合作用特点。清热活血方治疗MIRI机制可能涉及炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、自噬等多种途径，可为后续进一步的机制研究提供方向，但是各作用途径间是否存在相互调控的作用关系，仍有待后续的实验研究进一步验证。