授粉后不同时期玉米籽粒含水量相关QTL定位

吴文强， 赵 强， 赵满义， 郭向阳， 王安贵， 刘鹏飞， 祝云芳， 吴 迅， 陈泽辉(贵州省农业科学院旱粮研究所， 贵阳 550006)

玉米(ZeamaysL.)作为我国第一大粮食作物[1]，是国家粮食安全和经济社会发展的重要物质保障[2]。伴随劳动力成本的不断升高，全程机械化是玉米生产发展的必然之路[3]，在玉米全程机械化过程中，成熟期籽粒含水量是影响玉米机械收获质量、安全贮藏和经济效益的关键因素之一。我国许多玉米产区，收获时玉米籽粒含水量通常在30%～40%之间，难以实现机械粒收，易导致堆积晾晒过程中的霉变，影响玉米商用品质和营养品质[4]。选用成熟期籽粒脱水速度快的玉米杂交种既可以解决成熟期籽粒霉烂的问题，又能适应机械化生产的实际需求。因此，剖析籽粒含水量变异的遗传基础，鉴定控制玉米籽粒含水量变异的关键遗传区段，对于快速改良不同来源玉米种质的籽粒脱水性状，创新玉米材料具有较好的指导性。

Sala等[5]利用包含181份F2∶3家系的分离群体为材料，结合122个SSR标记对该群体的基因型鉴定结果，对成熟期玉米籽粒含水量进行研究，结果共定位到10个控制玉米籽粒含水量的QTL，可累积解释54.8%的籽粒含水量变异。李露露等[6]利用242个重组自交系群体为材料，结合916个SSR标记的基因型鉴定结果，定位到4个在两个环境下稳定表达的成熟期玉米籽粒含水量相关QTL，可累积解释21.71%的表型变异。Xiang等[7]通过对已报道的96个玉米籽粒含水量相关的QTL进行一致性分析，获得44个控制玉米籽粒含水量的关键QTL(Quantitative Trait Locus数量性状基因座)。这些研究结果为玉米籽粒含水量的遗传基础解析以及相关的分子辅助改良提供了很好的科学支撑。然而，玉米籽粒含水量作为复杂数量性状，是大量微效等位基因共同作用的结果[8-14]。基于少数玉米种质材料尤其是温带来源的玉米群体，以及低密度SSR标记所揭示的玉米籽粒含水量的遗传基础，对于深度揭示玉米种质籽粒含水量变异的遗传基础所提供的信息较为有限。尤其是关于热带种质成熟期籽粒含水量高的遗传机制的研究则鲜见报道。近年来，随着高通量的基因型鉴定技术的大量应用，结合连锁分析和高通量的基因型鉴定技术，深入解析重要性状变异的遗传研究，能够有效缩小目标QTL，提高定位结果的分辨率，该方法已经被大量应用在玉米重要性状的遗传区段鉴定上[15-16]，为玉米籽粒含水量变异的遗传基础解析提供了很好的借鉴作用。

为满足复杂生态环境条件对综合农艺性状、抗性等的特殊要求，育种家们通过构建温热群体并进行大量研究，证明了热带玉米种质具有较温带种质更为丰富的遗传多样性，热带种质携带了大量的优势等位基因[17-18]。但热带种质存在成熟期籽粒含水量高的不足，以热带种质改良选系所培育出的杂交种常常因为成熟期籽粒含水量高，导致其易感染穗腐病以及机械收获困难[19]。因此，利用脱水快的温带材料对热带种质进行改良，选育成熟期籽粒含水量低，且综合农艺性状优良的玉米自交系一直是热带种质改良和创新利用的核心内容。解析玉米籽粒含水量变异的遗传基础，挖掘控制籽粒含水量相关性状的遗传区段，对于充分利用热带种质的遗传优势以及改良其成熟期籽粒含水量高的不足，将具有十分重要的科学理论意义和实践利用价值。

1 材料与方法

1.1 材 料

本研究以玉米自交系HCL 645和ZHL 908为亲本构建的150份F2分离群体以及F2：3分离家系为材料。其中HCL 645是孟山都公司选育的温带玉米自交系，具有成熟期籽粒含水量低的特点，作为迪卡517的亲本，在温带地区，特别是中国北方地区得到广泛应用。ZHL 908是苏湾种质选育的自交系，成熟期籽粒含水量高，在中国南方广泛应用。

1.2 田间试验设计及表型评价

试验采用随机区组设计，单行区，行长3 m，株距0.25 m，行距0.6 m，并于2016年冬季在海南九所贵州南繁基地种植亲本和150个F2单株。于2017年夏季在贵州省农业院科学院试验基地(贵阳)种植亲本和150个F2∶3家系，田间管理同大田生产。籽粒含水量测定步骤如下：授粉后30 d开始测定籽粒含水量，每个家系连续选择10个单株，利用便携式籽粒测定仪(SMART SESOR)对果穗中部籽粒进行水分测定，每隔7 d重复测量一次，直到籽粒完全成熟(黑层出现)。

1.3 DNA提取和基因型鉴定

玉米5叶期，取F2单株幼嫩叶片，利用改良CTAB法提取基因组DNA，并将合格的DNA样品送北京康普森生物技术公司进行DNA质量评估和简化基因组测序(GBS)，鉴定基因型。

注：每行代表一个SNP标记，不同的颜色显示不同的标记密度。浅色表示标记的密度低，深色表示标记的密度高。图1 高密度遗传图谱Fig.1 High-density genetic map

注：图2～图6中x轴表示每个染色体上SNP标记的物理位置；y轴表示LOD值，虚线表示阈值。图2 控制授粉后30 d玉米籽粒含水量的相关QTLFig.2 QTL related to maize kernel moisture content after 30 days of pollination

1.4 数据分析

利用SAS 9.0、IciMapping等软件对数据进行方差分析和QTL定位，鉴定出控制玉米籽粒含水量的遗传区段。

1.5 QTL区段与玉米参考基因组比对

本研究QTL定位结果参照WU XUN等[20]研究结果，以物理位置表示。将定位到的控制授粉后不同时期玉米籽粒含水量相关QTL与已报道的相关QTL做一致性分析，获得相应的QTL重叠区段，并将这些重叠区段与玉米参考基因序列(Zm-B 73-REFERENCE-NAM-5.0)的物理位置进行比对，筛选相关功能基因。

2 结果与分析

2.1 高密度遗传图谱构建

利用5 636个SNP构建了高质量的遗传图谱(图2)。结果显示所有SNP均匀分布于10条染色体上。其中第四条染色体上SNP分布最多，为767个；第十条染色体上分布最少，为338个；其余染色体上SNP分布情况为：第一条染色体761个；第二条染色体654个；第三条染色体674个；第五条染色体556个；第六条染色体437个；第七条染色体523个；第八条染色体512个；第九条染色体414个。

2.2 授粉后不同时期控制玉米籽粒含水量的QTL

利用完备区间作图法，定位到控制授粉后不同时期玉米籽粒含水量的QTL共21个，结果列于表1。分析发现，这些QTL分别位于第一、第二、第三、第五、第六、第七、第八、第九条以及第十条染色体上。单个位点可解释4.02%～16.10%的籽粒含水量变异，单个QTL大小在69.17 ～5 814.12 kb之间，其中qKC 51-6与qKC 58-6为同一个QTL，控制授粉后51 d以及58 d玉米籽粒含水量(表2)。

表1 控制授粉后不同时期玉米籽粒含水量的相关QTLTable 1 QTL related to maize kernal moisture content at different periods after pollination

其中，控制授粉后30 d玉米籽粒含水量的QTL qKC 30-9位于第九染色体上(表1，图2)，大小为798.00 kb，LOD值为3.50，贡献率为13.76%(表1)，表现出较高的遗传效应。

定位到控制授粉后37 d玉米籽粒含水量的QTL总共5个，分别是qKC 37-3、qKC 37-5、qKC 37-6、qKC 37-7、qKC 37-9(表1)，其中，qKC 37-3位于第三染色体(表1，图3)，大小为592.24 kb，LOD值为7.29，贡献率为13.15%(表1)；qKC 37-5位于第五染色体(表1，图3)，大小为2 844.67 kb，LOD值为3.45，贡献率为5.91%(表1)；qKC 37-6位于第六染色体(表1，图3)，大小为93.04 kb，LOD值为6.12，贡献率为10.81%(表1)；qKC 37-7位于第七染色体(表1，图3)，大小为884.15 kb，LOD值为7.63，贡献率为14.99%(表1)；qKC 37-9位于第九染色体(表1，图3)，大小为948.64 kb，LOD值为4.34，贡献率为8.60%(表1)。qKC 37-3和qKC 37-6表现出较高的遗传效应。

图3 控制授粉后37 d玉米籽粒含水量相关QTLFig.3 QTL related to maize kernel moisture content after 37 days of pollination

定位到控制授粉后44 d玉米籽粒含水量的QTL共计2个，分别是C 44-2、qKC 44-5，其中，qKC 44-2位于第二染色体(表1，图4)，大小为476.60 kb，LOD值为3.41，贡献率为16.10%(表1)；qKC 44-5位于第五染色体，大小为790.90 kb，LOD值为4.38，贡献率为9.91%(表1)。qKC 44-2表型表现出较高的遗传效应。

图4 控制授粉后44 d玉米籽粒含水量相关QTLFig.4 QTL related to maize kernel moisture content after 44 days of pollination

定位到授粉后51 d控制籽粒含水量的QTL共计9个，分别是qKC 51-1、qKC 51-2-1、qKC 51-2-2、qKC 51-3-1、qKC 51-3-2、qKC 51-6、qKC 51-9、qKC 51-10-1、qKC 51-10-2(表1)。其中，qKC 51-1位于第一染色体(表1，图5)，大小为1 232.10 kb，LOD值为6.41，贡献率为7.11%(表1)；qKC 51-2-1位于第二染色体(表1，图5)，大小为5 814.12 kb，LOD值为3.79，贡献率为4.02%；qKC 51-2-2位于第二染色体(表1，图5)，大小为442.80 kb，LOD值为5.46，贡献率为7.907 5%(表1)；qKC 51-3-1位于第三染色体(表1，图5)，大小为503.88 kb，LOD值为5.19，贡献率为5.67%(表1)；qKC 51-3-2位于第三染色体(表1，图5)，大小为387.71 kb，LOD值为6.34，贡献率为7.13%(表1)；qKC 51-6位于第六染色体(表1，图5)，大小为1 599.36 kb，LOD值为11.70，贡献率为14.77%(表1)；qKC 51-9位于第九染色体(表1，图5)，大小为739.28 kb，LOD值为4.47，贡献率为5.81%(表1)；qKC 51-10-1位于第十染色体(表1，图5)，大小为135.77 kb，LOD值为9.35，贡献率为12.50%(表1)；qKC 51-10-2位于第十染色体(图5)，大小为424.88 kb，LOD值为6.25，贡献率为7.387 7%(表1)。qKC 51-6表现出较高的遗传效应。

图5 控制授粉后51 d玉米籽粒含水量相关QTLFig.5 QTL related to maize kernel moisture content after 51 days of pollination

定位到控制授粉后58 d玉米籽粒含水量的QTL共计4个，分别是qKC 58-2、qKC 58-3、qK C58-6、qKC 58-8(表1)。其中，qKC 58-2位于第一染色体(表1，图6)，大小为1 242.86 kb，LOD值为5.98，贡献率为11.88%(表1)；qKC 58-3位于第三染色体(表1，图6)，大小为69.167 kb，LOD值为4.24，贡献率为7.60%(表1)；qKC 58-6位于第六染色体(表1，图6)，大小为1 599.36 kb，LOD值为6.16，贡献率为11.51%(表1)；qKC 58-8位于第八染色体(表1，图6)，大小为583.61 kb，LOD值为3.91，贡献率为7.002 1%(表1)。qKC 58-2和qKC 58-6表现出较高的遗传效应。

图6 控制授粉后58 d玉米籽粒含水量相关QTLFig.6 QTL related to maize kernel moisture content after 58 days of pollination

2.3 QTL一致性分析与功能基因筛选

通过将本研究所定位到的控制玉米籽粒含水量相关QTL与已报道的QTL做一致性分析，结果(表2)显示，本研究所定位到的QTL qKC 44-2和qKC 51-6/qKC 58-6分别与Xiang K等[7]定位到的QTL GM 13和GM 28相重叠；其中，qKC 44-2与GM 13重叠区段为207 170 196～207 285 485， QTL大小由2 412.28 kb缩短至115.29 kb；qKC 51-6/qKC 58-6与GM 28重叠区段为115 308 486～115 350 163，QTL区段由1 675.60 kb缩短至41.68 kb；通过一致性分析，大幅缩短了目标QTL区段大小。

通过一致性分析，获得2个控制授粉后不同时期玉米籽粒含水量的QTL重叠区段，分别将两个QTL重叠区段与玉米参考基因组进行线性比对，共筛选到6个候选功能基因(表2，图7，图8)。

图8 QTL qKC 51-6/qKC 58-6和GM 28重叠区段内的候选基因Fig.8 Candidate genes located in the common regions between QTL qKC 51-6/qKC 58-6 and GM 28

其中，在qKC 44-2与GM 13重叠区段内共鉴定出3个候选功能基因：Zm00001eb105320、Zm00001eb105330和GRMZM5G803419(表2，图7),其中Zm00001eb105320和GRMZM5G803419为蛋白编码基因，Zm00001eb105330为非蛋白编码基因(图7)[21-22]，并且两个蛋白编码基因所编码的蛋白功能尚未明确，其与控制授粉后不同时期玉米籽粒含水量是否相关需要进一步研究。

表2 QTL一致性分析Table 2 QTL consistency analysis

图7 QTL qKC44-2和GM 13重叠区段内的候选基因Fig.7 Candidate genes located in the common regions between QTL qKC44-2 and GM 13

此外，qKC 51-6/qKC 58-6与GM 28重叠区段与玉米参考基因组比对筛选到3个候选功能基因Zm00001eb277540、Zm00001d036986、GRMZM2G029506(表2，图8),3个候选功能基因均为蛋白编码基因(图8)；其中，Zm00001d036986，GRMZM2G029506所编码的蛋白功能尚未明解；而Zm00001eb277540基因所编码的ABC transporter G family member 34蛋白与ATP酶偶联跨膜转运体活性相关[21]；ATP酶偶联跨膜转运体活性直接影响相关的跨膜运动活动的强弱，可能与授粉后不同时期玉米籽粒含水量相关，该基因将作为研究授粉后不同时期玉米籽粒含水量的目标基因，进行相关基因功能的研究。

3 讨 论

在前人的研究中，已发现一些与玉米籽粒含水量相关的QTL，例如Sala等[5]定位到10个相关QTL，可累积解释54.80%的表型变异；李露露等[6]定位到4个相关QTL，可累积解释21.71%的表型变异；Xiang等[7]通一致性分析，获得44个与籽粒含水量相关的关键QTL。本研究以籽粒含水量差异较大的两个亲本构建的双亲分离群体为材料，基于GBS测序和表型鉴定结果，利用完备区间作图法定位到控制玉米授粉后不同时期籽粒含水量的QTL共21个(表1)，单个QTL大小变幅在69.17～5 814.12 kb之间；单个QTL的LOD值变幅在3.41～11.70之间；单个QTL可解释4.02%～16.10%表型变异(表1)。其中，定位于第二条染色体控制授粉后44 d玉米籽粒含水量的QTL qKC 44-2(物理位置为：207 170 196～207 646 801)与GM 13(物理位置：183 162 723～207 285 485)[7]重叠，重叠区域为第二条染色体核苷酸207 170 196～207 285 485，成功将该QTL区段由2 412.28 kb缩小至115.29 kb(表2)。定位于第六条染色体控制授粉后51 d和58 d籽粒含水量的QTL qKC 51-6/qKC 58-6(物理位置：113 750 808～115 350 163)(表1)与GM 28(物理位置：115 308 486～132 064 497)[7]重叠，重叠区域为第六条染色体核苷酸115 308 486～115 350 163，成功将该QTL由1 675.60 kb缩小至41.68 kb(表2)。生物信息分析发现，在这两个区段内共筛选到6个候选功能基因，其中5个为编码蛋白基因，1个为非编码蛋白基因。其中编码ABC transporter G family member 34蛋白的Zm00001eb277540基因将作为控制授粉后不同时期玉米籽粒含水量的目标功能基因，进行深入研究(表2，图8)。此外，本研究还检测到19个新的控制授粉后不同时期玉米籽粒含水量QTL，分别位于除第四条染色体以外的9条染色体上(表1)。这些研究结果可为深度解析玉米籽粒含水量相关性状变异的遗传基础提供分子依据，还为下一步玉米籽粒含水量相关候选基因的图位克隆提供靶标。