不同百香果品种对茎基腐病的抗性鉴定及防御酶活性研究

吴应海李安定张丽敏彭熙蔡国俊张孙健

(1.贵州科学院山地资源研究所，贵州 贵阳 550001；2.贵州科学院生物研究所，贵州 贵阳 550009)

百香果(Passiflora edulia)又名西番莲、鸡蛋果、洋石榴。是西番莲科(Passifloraceae) 西番莲属(Passiflora L.)多年生半木质化藤本植物，原产于南美洲，我国在20世纪80年代开始引入台湾、福建、广东等地区种植，近年来作为贵州农业特色优势产业发展，2020年百香果在贵州推广面积达到了11666.67hm2，由于连续种植造成很多果园百香果病害频发，这不仅对百香果产量造成巨大损失，还严重制约贵州百香果产业可持续高质量发展。

百香果茎基腐是百香果最主要病害，其病原菌主要是镰刀菌(Fusarium sp.)，通常病菌以菌丝体在病株或土壤中越冬，翌年随着气温逐步升高菌丝体逐步萌发，发病高峰期为每年5—7月，植株在苗期及成株期均可染病，主要危害部位为植株茎基部。幼苗染病后表现为叶片萎蔫脱落直到死亡，成株染病初期会在茎基部出现褐色病斑，接着病部皮层出现变软腐烂，进一步皮层与木质部脱落，随着病斑横向扩展环绕整个茎秆时，上部枝蔓及叶片出现黄化、萎蔫，直到病斑扩展到根部导致整个植株死亡。在百香果种植过程中遇到高温高湿、土壤偏酸、重茬、后期果园清理不干净等情况非常容易感染茎基腐病，这对于最终产量及经济效益是一个不可忽视的的因素[1-3]。

研究植物抗病性是科学研究热点，开展植物抗病研究对于作物产量及品质提高具有重要意义,也对植物及环境保护具有重要作用[4]。植物抗病性主要有形态结构抗病及生理生化抗病性，结构抗病主要通过植株特殊形态结构物理性抵御病原菌侵入。生理生化抗病是指植物体内的一些防御酶，其中主要有POD、CAT、SOD、PPO、PAL等防御酶，这些防御酶含量不仅对于植物形态构建具有重要意义，而且对于植物抗性具有重要决定作用[5]。这些酶活性高低直接影响着植物抗病性强弱，因此这些酶活性高低和峰值出现早晚可作为植物抗性水平和筛选抗病植物品种重要参考标准。本研究针对百香果不同品种茎基腐病抗性鉴定试验具有一定创新性，目前国内研究较少，这对于后期开展百香果茎基腐病预防与治理提供生理生化方面的理论依据，同时为百香果抗病砧木及抗病品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试百香果品种

本试验设在贵州科学院山地资源研究所产学研基地试验站，试验站位于贵州省平塘县克度镇，N106°48′14.23″，E25°43′48.05″，海拔891m。棚内温度控制在20～25℃，选用黄果品种(“黔黄1号”、“芭乐味黄金果”)；紫果品种(“贵寒1号”、“台农1号”、“紫香1号”)；绿皮品种(“绿皮荔枝味百香果”)，共6个品种为试验对象，每个品种选取30株长势基本一致，苗龄相同植株，采用盆栽14d后开始茎基腐病菌接种试验(“贵寒1号”原代码“平塘1号”)。

1.1.2 供试菌种

百香果茎基腐病菌：镰刀菌(Fusarium sp.)，由福建省农业科学院植物保研究所兰成忠老师团队分离、鉴定、保存供试。

1.2 方法

1.2.1 接种感病指数

1.2.1.1 叶片病菌接种

病菌接种叶片和茎基部为活体接种，采用活体针刺接种自然发病法[6]，种植14d后的百香果苗从顶端开始选择第2～4张成熟叶片作为接种叶片，叶片接种前用无菌脱脂棉蘸取75%酒精反复擦洗几次，然后用无菌水擦洗3～5次。用灭菌解剖针在百香果叶片上以叶脉为中轴线两边各取3个接种点，每个点之间相距约2cm，每个品种接种10株，每株接种2片叶片(1片作实验组，1片作对照组),用解剖刀在25℃黑暗培养7d的百香果茎基腐病菌落菌丝0.5mm～1cm的菌块贴于针刺处，用无菌PDA培养基作为接种对照。然后用沾有1%的葡萄糖水的脱脂棉覆于上面并用20cm×22cm的密封袋将整张接种的叶片密封起来，在控温大棚中(22～25℃)中保湿72h后，逐日记录菌斑大小。

1.2.1.2 茎基部病菌接种

每一试验品种选择10株，在茎基部离地面5cm位置先用沾有75%的酒精脱脂棉反复擦洗，之后用沾有清水的脱脂棉擦洗干净，并用已灭菌接种针在茎上环扎4孔，取25℃黑暗培养7d的百香果茎基腐病菌落菌丝0.5mm～1cm的菌块贴于针刺处，用无菌PDA培养基作为接种对照。然后用沾有1%葡萄糖水的脱脂棉包裹困扎在上面。之后每隔7d观察每1株的发病情况，并作记录。

1.2.2 感病评价

叶片接种后每周调查记录病斑扩展情况，采用“十字交叉法”测量病斑直径。感病指数[7-10]计算公式：

病害程度的分级根据病斑扩展情况确定，分级标准：病级Ⅰ，感病程度为病斑无扩展；病级Ⅱ，感病程度为病斑1～3mm扩展；病级Ⅲ，感病程度为病斑3.1～6.0mm扩展；病级Ⅳ，感病程度为病斑6.1～9.0mm扩展；病级Ⅴ，感病程度为病斑9.1mm以上扩展。根据病斑指数计算结果，将抗病品种等级进行划分：感病指数1～35为高抗品种；感病指数36～45为中抗品种；感病指数在45以上为高感品种。

1.2.3 生长指标的测定

在接种病菌21d后进行取样，参照褚群和赵加欣等方法[11]测量不同处理株高、茎粗、根系鲜重、地上部分鲜重、根体积、根系干重、地上部分干重。

1.2.4 取材及样品处理

选择茎基部接种病菌植株作为试验取材对象，自嫩芽以下完全成熟叶片分别于接种0d、7d、14d、21d取样，设置3次重复，每个重复3株。将相同处理叶片放入有冰袋的样品箱中，标记后迅速带回实验室放置于-20℃冰箱中保存，用于防御酶活性测定。

1.2.5 测定的项目及方法

过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定均由北京索莱宝科技有限公司提供的检测试剂盒，试剂盒编号分别为BC0090、BC0200、BC0170、BC0190、BC0210。

1.3 数据分析

试验数据采用WPS Office软件、SPASS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 接种结果

接种尖孢镰刀菌后10d测量菌斑大小，并取样拍照，从图1可以看出,6个百香果品种均不同程度感病，但感病最严重的是“绿皮荔枝味百香果”，见图1f，感病最轻的是“黔黄1号”，见图1a。

图1 百香果不同品种接种病菌后的病斑生长情况

如表1所示，供试的6个百香果品种接种镰刀菌后，感病程度有很大差别，其中“绿皮荔枝味百香果”、“紫香1号”感病较重，病斑扩展长度较大，病斑分别为4.35mm、4.24mm，感病指数分别为59.72、56.53，为高感品种;其次是“台农1号”与“贵寒1号”，病斑为长度分别为3.45mm、3.23mm，病情指数分别为45.83、40.28，为中抗品种；“黔黄1号”与“芭乐味黄金果”病斑较小，病斑长度分别为2.15mm、2.43mm，感病指数分别为23.61、30.89，为高抗品种。感病指数最高是“绿皮荔枝味百香果”，最低是“黔黄1号”，而且两者之间病斑长度差异显著，对接种感病后叶片病原再分离，获得的病原菌与接种病原一致，对照处理叶片未发病。

表1 不同百香果品种接种病菌后感病结果

2.2 不同百香果品种接种茎基腐病菌对地上部分及地下部分的影响

如表2所示，对6种不同品种百香果茎基部接种镰刀菌后21d，分别对株高、茎粗、根系鲜重、根系干重、地上部分鲜重、根系体积、地上部分干重进行统计分析发现，实验组各项考察指标均低于对照组，这说明接种镰刀菌确实影响百香果的生长。黄果品种各项测试数据实验组与对照组影响最小，其次是紫果品种，绿皮品种影响最大。

表2 不同百香果品种接种镰刀菌后各项指标变化

2.3 不同百香果品种接种茎基腐病菌后POD活性变化

过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶，在植物生长发育过程中其活性不断发生变化，一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱，是植物体内重要的活性氧清除剂。由图2可知，接种后各百香果品种POD酶活性都出现了先上升后下降趋势，黄果品种酶活性最高，酶活性分别是3.53U·g-1、2.93U·g-1，而且酶活性峰值出现较早，在接种病菌7d出现了峰值，其他百香果试验品种在接种14d出现峰值。

2.4 不同百香果品种接种茎基腐病菌后CAT活性变化

过氧化氢是生物代谢过程中产生的代谢废物，其大量的累积能够对机体细胞造成严重的损害，为了避免这种损害，过氧化氢必须被快速地转化为其他无害或毒性较小的物质，而过氧化氢酶就是常常被细胞用来催化过氧化氢分解的工具。当生物体细胞被病原体感染时，过氧化氢酶活性则升高来分解微生物，从而提高机体抗病性[12]。如图3所示，百香果品种接种病菌后CAT酶活性逐渐上升，其中黄果种酶活性较高，酶活性分别为2.65U·g-1、2.01U·g-1，并且在接种病菌7d后达到峰值，而其他的品种则在14d达到峰值。

2.5 不同百香果品种接种茎基腐病菌后SOD活性变化

超氧化物歧化酶(SOD)是一种含金属的抗氧化酶，在活性氧清除反应过程中第1个发挥作用,在抗氧化酶类中处于核心地位,能将超氧物阴离子自由基(O2-)快速歧化为过氧化氢(H2O2)和分子氧。SOD是植物重要抗逆性指标之一，在保护细胞免受氧损伤过程中具有十分重要作用[13]。由图4可知，在接种病菌后，酶活性逐渐增加，黄果品种酶活性较高，酶活性迅速升高，在接种7d后达到峰值，其他品种则也是14d到达峰值。

图2 接种病菌后不同百香果品种叶片POD活性变化

图3 接种茎基腐病菌后不同百香果品种叶片CAT活性变化

图4 接种茎基腐病菌后不同百香果品种叶SOD活性变化

2.6 不同百香果品种接种茎基腐病菌后PPO活性变化

多酚氧化酶是一种广泛存在于植物各组织氧化酶，其是一种含铜离子膜蛋白结合酶，多酚氧化酶通过催化木质素及醌类化合物形成，构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌侵害，也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用[14,15]。由图5可知，接种病菌后黄果品种明显高于其他品种，所有品种都是在接种茎基腐病菌14d后酶活性达到最大值，“黔黄1号”及“芭乐味黄金果”酶活性最大，酶活性分别是3.13U·g-1、2.93U·g-1，两者间酶活性差异显著。“紫香1号”酶活性最小，酶活性为0.97U·g-1。

2.7 不同百香果品种接种茎基腐病菌后PAL活性变化

苯丙氨酸解氨酶(PAL)广泛存在于植物中，其为植物体次生代谢的关键酶及限速酶，在植物体内苯丙烷类物质代谢中起到关键酶作用，苯丙烷类代谢进一步形成咖啡酸、绿原酸、类黄酮和木质素等多种抗菌物质的主要途径，病原菌侵染和病原菌毒素处理都能诱导苯丙氨酸解氨酶活性增强，且酶活增强与抗病性成正相关[16-18]。如图6所示，总体上说，黄果品种的苯丙氨酸解氨酶活性高于紫果品种，最低是“绿皮荔枝味百香果”。接种茎基腐病菌后所有品种苯丙氨酸解氨酶均上升，并在14d达到最大值。

图5 接种茎基腐病菌后不同百香果品种叶PPO活性变化

图6 接种茎基腐病菌后不同百香果品种叶片PAL活性变化

3 结论与讨论

在本试验分别通过对不同百香果品种叶片及茎基部接种茎基腐病菌后，不同百香果品种间菌斑长度出现显著性差异，菌斑较小的为黄果品种“黔黄1号”、“芭乐味黄金果”，其次为紫果品种“贵寒1号”、“台农1号”、“紫香1号”，菌斑最大的为绿果品种“绿皮荔枝味百香果”。感病指数最高的是“绿皮荔枝味百香果”，最低的是“黔黄1号”。与此同时，对6种不同品种百香果茎基部接种镰刀菌后21d，分别对株高、茎粗、根系鲜重、根系干重、地上部分鲜重、根系体积、地上部分干重进行统计分析发现，试验组各项考察指标均低于对照组，这说明接种茎基腐病菌对百香果的生长发育确实造成一定影响。接种后0d、7d、14d、21d的叶片取样，对接种POD、CAT、SOD、PPO、PAL活性测定发现，抗性较强的黄果品种POD、CAT、SOD酶活性普遍比其它供试品种高，且峰值出现比其他紫果种和绿果种早。百香果不同品种对茎基腐病的抗性规律：黄果品种>紫果品种>绿皮品种；抗性越强的品种其5种防御酶活性普遍较高，且POD、CAT、SOD 3种酶活性出现峰值时间越早。