高脂血症对动脉内皮糖萼及动脉粥样硬化的影响

潘俊，孙世超，罗雅娴，周扬，周晨明，徐彦楠

（河北医科大学，河北 石家庄 050017）

0 引言

高脂血症（Hyperlipidemia，HLP）是由于人体内脂肪代谢或转运异常引起的血清脂质和脂蛋白水平升高的一种代谢性疾病[1]。其作为动脉粥样硬化的首要危险因素，已被循证医学证实是心脑血管病的独立危险因素之一[2]。内皮糖萼（Endothelialglycocalyx, EGX）主要覆盖于的血管内皮上，位于血管内皮与血液之间的复合物[3]。其作为血管内皮的屏障，在调节血管通透性、调节炎症反应、感测流体的剪切力、抗凝等起着重要作用[4]。虽然近些年内皮糖萼相关研究逐年增多，但是内皮糖萼在动脉粥样硬化中所起作用的具体机制尚不清楚。因此，本文旨在探讨高脂血症对动脉内皮糖萼及动脉粥样硬化的影响，以期为动脉粥样硬化机理的阐释及其防止提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验以5月龄仓鼠为动物模型，将动物分为对照组和实验组，每组各五只。对照组以普通繁殖饲料喂养12周，实验组喂养高脂饲料12周（10%猪油，5%蔗糖，2%胆固醇，0.5%牛胆盐，0.2%丙基硫氧嘧啶）。所有实验动物饲养于河北医科大学实验房，遵循PF级S实验动物饲养条件。

1.2 方法

1.2.1 相关试剂

醛镧灌流固定液：1%硝酸镧-3%戊二醛-2%多聚甲醛-0.1mol/L二甲砷酸钠

电镜标本制备所需漂洗液：1%硝酸镧-0.1mol/L二甲砷酸钠

1.2.2 标本的收集

用4%水合氯醛经腹腔注射麻醉，打开胸腔，暴露心脏，剪开右心耳，用注射器从右心耳采集心脏血液2mL，置于4℃冰箱保存待测。取血后，立即采用硝酸镧示踪技术，用醛镧灌流固定液进行灌流固定，取胸主动脉，分成三部分：经石蜡包埋切片后进行HE染色；经冰冻切片后进行油红O染色。经树脂包埋，进行透射电镜观察。

1.2.3 血清学检测

将 收集 的血 液离 心 (4000r/min，10 min)，取上层血浆样品，用酶反应比色法按照试剂盒说明书检测总胆固醇(TC)、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。

1.2.4 HE染色

取一段胸主动脉标本经脱水、透明、浸蜡及包埋后，切成厚度为2μm的石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡、乙醇水化、苏木素和伊红染色，逐级梯度酒精脱水，二甲苯透明，晾干后用中性树胶封片，显微镜采集图像。

1.2.5 油红O染色

取一段胸主动脉标本在冰冻切片机上切成 8 μm 厚的切片，切片经60%异丙醇2min，用提前配置好的油红 O 染液避光染色10min，60%异丙醇染色5s，随后用苏木素染色染核 5 min，甘油明胶进行封片，显微镜采集图像。

1.2.6 硝酸镧示踪透射电镜技术

取一段胸主动脉标本，经醛镧灌流固定液前固定液 4℃ 固定过夜，漂洗液漂洗3次，1% 四氧化锇-1%硝酸镧后固定2h，经50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机切50nm超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色，在透射电镜下检测、拍照。相同放大倍数下,每只鼠拍照不同部位的内膜照片5 张，每张图用 Photoshop 软件分割成等份的方格，测量每个方格内由内皮细胞上糖萼层顶端到内皮细胞膜的垂直距离，然后进行统计学分析。

1.2.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示，作单因素方差分析(One-Way ANOVA)，结果P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清学检测

为了检测造模是否成功，对实验动物进行血清学检测，结果显示：与对照组相比，模型组TC、TG、LDL-C水平显著升高， HDL-C水平降低（P＜0.05），两组差异有统计学意义（图1）。

图1 两组血脂水平比较

2.2 HE染色

结果显示，对照组主动脉血管壁结构清晰，内皮表面光滑，厚度分布均匀，结构完整，中膜平滑肌细胞排列规则，无增生；而模型组，内皮表面粗糙，厚薄不均，凹凸不平，中膜平滑肌排列紊乱，细胞间纤维组织异常增生（图2）。

图2 两组主动脉HE染色的观察(A:对照组 B：模型组)

2.3 油红O染色

结果显示:对照组主动脉内膜无脂质沉积；而模型组可见动脉内膜有明显的脂质沉积（图3）。

图3 两组主动脉油红O染色的观察(A:对照组 B：模型组)

2.4 透射电镜观察内皮糖萼超微结构的改变。

结果显示对照组内皮糖萼分布均匀，厚薄一致；而模型组内皮糖萼层变薄变稀疏，并伴有部分缺失的现象（图3）。经测量统计后，对照组内皮糖萼平均厚度为（353.13±181.81）nm，模型组为（188.33±119.50）nm，两组之间差异有统计学意义 (P＜0.05)（表1）。

图3 两组主动脉内皮糖萼透射电镜的观察(A:对照组 B：模型组)

表1 两组内皮糖萼的厚度比较（±s）

注 : *P＜0.05 vs 对照组

组别 n 内皮糖萼厚度(nm)对照组 5 353.13±181.81模型组 5 188.33±119.50 F值 5.565 P值 ＜0.05

3 讨论

随着经济的发展，人口老龄化及人们生活习惯的改变，动脉粥样硬化已成为全球死亡率上升的主要原因之一[5]。作为心脑血管疾病的病理基础，动脉粥样硬化的预防与治疗已成为重点研究对象，而血脂异常又是动脉粥样硬化发病的主要因素之一[6]。

目前，小鼠和大鼠已被广泛应用于动脉粥样硬化的研究。但有研究显示，小鼠以及大鼠对饮食诱导的动脉粥样硬化具有不同程度的抵抗力，而仓鼠在高脂模型的制备中，主动脉和冠状动脉中显示出更多的动脉粥样硬化病变，因此本实验选用仓鼠作为高脂血症模型动物[7]。高脂血症是脂质异常的一种表现，其特征是TC、TG、LDL明显升高，HDL降低。虽然高脂血症不能直接引起显著的临床症状，但由于胆固醇和甘油三酯在器官内的积累，高脂血症可导致动脉粥样硬化性心血管疾病[8]。本实验通过对模型组给予高脂饮食喂养，结果发现与对照组相比，模型组血清中的TC、TG、LDL明显升高，HDL降低，提示高脂血症模型造模成功。

动脉粥样硬化形成因素众多，其中高血脂尤为显著。动脉粥样硬化的发病机制“脂质浸润学说”认为，过量的TC 在血管壁沉积后，引起巨噬细胞和平滑肌细胞吞噬脂质，形成泡沫细胞，同时使内皮增厚[9]。此外，过量的LDL积聚于内皮下，并被血管壁分泌的氧化活性物质氧化修饰形成ox-LDL，与此同时又触发血管壁的炎症反应，引发了如血管内皮细胞粘附分子-1（(VCAM-1)）、E-选择素、P-选择素等多种炎症因子的表达[10]。在驱化作用下，单核细胞进入血管壁并分化为巨噬细胞，摄取ox-LDL成为泡沫细胞，进一步导致血管炎症和动脉粥样硬化的形成[11]。本实验通过用HE染色和油红O染色对血管内皮进行观察，结果发现内皮不均匀增厚增厚，且有脂质沉积，内膜呈现粥样硬化的早期病理改变。

内皮糖萼主要由蛋白聚糖、糖胺聚糖、糖蛋白、糖脂构成的复合物，是血管内皮的重要屏障[12]。钌红染色是透射电镜观察糖萼的经典方法，但其具有局限性，因钌红属于大分子物质，不能完全进入整个糖萼层使其着色，影响观察，并且钌红易与糖萼侧链作用改变其空间几何构型，从而造成观察上的假象，因此本实验应用硝酸镧示踪来显示内皮糖萼超微结构, 实验结果直观且明确。透射电镜结果显示与对照组相比，模型组内皮糖萼层变薄变稀疏，并伴有部分缺失的现象。提示高脂血症可破坏内皮糖萼。有研究表明内皮功能障碍是动脉粥样硬化病理进展的始动因素[13]。糖萼脱落导致内皮细胞结构发生变化，使其通透性增加，促进血管壁脂质沉积以及炎症因子释放，从而诱导单核细胞黏附、巨噬细胞浸润以及泡沫细胞形成，加速动脉粥样硬化疾病的进展[14]。此外，糖萼脱落导致细胞间通讯功能改变，剪切力传导障碍，进一步促进动脉粥样硬化斑块的形成。

综上所述，高脂血症在影响内皮结构的同时还破坏内皮糖萼，而内皮糖萼的破坏又进一步促进了脂质的沉积，二者共同促进了动脉粥样硬化的发生。本实验为动脉粥样硬化机理的阐释及其防止提供新的理论依据。